白花泡桐抗菌活内生真菌的筛选及其培养条件的优化.pdfVIP

摘 要 摘 要 随着抗生素和防腐剂的大量使用，耐药性菌株大量产生，这对食品安全和人 类健康造成威胁，因此开发新的抑菌活性物质已迫在眉睫。内生真菌是指那些在 其生活史中的某一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织和器官内部，并与植物 建立和谐联合关系的一类微生物。研究证明内生真菌能产生与宿主植物相同或相 似的抗菌、抗癌、抗氧化、抗糖尿病和免疫抑制的次生代谢产物。近期研究结果 表明约 51%的生物学活性物质来自于以前未知的药用植物内生菌，而这些活性物 质对耐药性菌株有很强的抑菌活性。白花泡桐是一种具有产生良好抗菌抗癌活性 物质的药用植物，但有关白花泡桐植物内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性研究国 内外尚未见报道。本研究学从白花泡桐中分离内生真菌并对分离菌株进行了抗菌 活性筛选，为白花泡桐内生真菌活性物质的研发奠定基础。 采用组织分离法从泡桐根、茎、叶中分离得到36 株内生真菌，其中根5 株、 茎15 株、叶16 株，通过形态学观察去重得到19 株菌落形态有明显的差异的内真 生菌。通过形态特性观察将11 株产子实体内生菌分别鉴定为半知菌亚门的赤霉菌 属（Gibberella sp.) 、曲霉属（Aspergillus sp.) 、交链孢属(Alternaria sp.)、青霉菌属 (Penicillium sp.) 、镰孢属(Fusarium sp.) 、茎点霉属(Phoma sp.) 、头孢霉属 （Cephalosporium sp. ）和子囊菌亚门的球座菌属(Guignardia sp.)等8 属，而对不产 子实体的8 株菌未进行鉴定。 采用琼脂块法和纸片法检测菌落形态有明显差异的19 株内生真菌对枯草芽孢 杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌活性，筛选出5 株抑菌活性较强的内生真菌， 并用琼脂块法检测传代培养后菌丝体的抑菌活性。检测抑菌效果稳定的菌株对致 病菌多杀性巴氏杆菌 C48-3 、C51-3 和X-73 的抑菌活性。结果表明在琼脂块法抑菌试 验中12 株菌至少对1 种测试菌有抑菌活性，10 株菌至少对2 种测试菌有抑菌活性， 3 株菌对3 种测试菌均有抑菌活性。在纸片法抑菌试验中 12 株菌的培养液至少对 1 种测试菌有抑菌活性，11 株菌至少对 2 种测试菌有抑菌活性。通过传代培养菌 株抑菌试验筛选了3 株抑菌效果稳定的真菌JM-7 ，JM-2 和JSD-8 ，其中JSD-8 对 血清型A ：1 和A ：3 的多杀性巴氏杆菌均有较强的抑制活性。 采用CTAB法制备5株抑菌活性菌株的基因组DNA ，用引物ITS5和ITS4经以基 第 i 页 摘 要 因组DNA为模板PCR扩增rRNA-ITS序列，纯化PCR产物、DNA测序，做序列对比 分析。ITS序列系统发育分析结果表明，JM-1株属于交链孢霉（Alternaria sp. ）， JM-10株属于青霉（Penicillium sp. ) ，JM-2株、JM-7株和JSD-8株均为赤霉菌属 （Gibberella sp.) ，与形态学鉴定结果一致。 通过单因子试验和正交试验对抑菌活性菌株JSD-8 的培养条件和培养基成分 进行了优化。单因子试验结果表明，菌株JSD-8最适培养温度为28 ℃，最适pH值为 6.0，摇床转速为140 r/min，接种量为10%，培养基体积为40% 。正交试验结果显示 菌株JSD-8株生长的最佳培养基成分为马铃薯30%，葡萄糖2.5% ，蛋白胨0.2% 。 主题词：白花泡桐；内生真菌；抗菌活性；形态特征；ITS 序列 第 ii 页 ABSTRACT ABSTRACT World health and food safety problems caused by drug-resistant bacteria and fungi are increasing.