细胞培养技术笔记.docxVIP

CO2培养调节pH本身分解HCO3可逆H+ + CO2 平衡。于是溶液中酸碱中和就不关CO2的事了 原代鸡胚成纤维细胞可以传代,但是最多传2代就不行了,表现为极易衰老,细胞形态不佳.所以一般我们选择传1代.现在有CEF传代细胞系,DF1,但是很娇贵,营养要求比原代的要苛刻. 传代和做原代用的试剂差不多：无EDTA，Hanks‘，10%或8%血清的DMEM或MEM（根据自己手头上的试剂选择）。胰酶和培养基先37度预热，否则细胞消化不开，成团细胞多，死细胞多。 其中梭形的细胞应该是成纤维细胞。左下方的多边形或圆形细胞应该为上皮样细胞。最大的干扰就是上皮细胞。 细胞种类：鸡胚成纤维细胞传代细胞系（UMNSAH/DF-1） 培养的天数：2 放大倍速：倒置显微镜X50 培养基种类：DMEM+10%小牛血清，最好39度培养，37度也可 细胞状态与特征简述:成纤维状，梭形，生长速度中等 ，贴壁生长 细胞培养用水，必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。 在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 过滤消毒： 1. 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 2. 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 3. 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 4. 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。 HEPES溶液： HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 ？配制培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。 培养基 1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。 2. 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。 3.2. 材料： 纯水（mil