实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验 2009.12.01.pptVIP

实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验 目的 本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方法的基本操作步骤。 原 理 不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第12～14天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细胞染色体畸变效应。 仪器和器械 生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻璃染色缸、擦镜纸等。 试剂 姬姆萨（Giemsa）染液??  Giemsa染料?????????????3.8 g  甲醇??????????????????????? 375 ml 甘油??????????????????????? 125 ml 配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，两周后使用。 试剂 0.04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存; 低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml 60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml 固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用时现配, 400ml; 试剂 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二钠：4.74g） 磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 加蒸馏水至 1000 ml Giemsa应用液:取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成，临用时配制。 试验设计 实验动物 7～12周龄健康雄性小鼠，每组保证至少5只存活 剂量分组 阴性对照组 溶剂 阳性对照组 丝裂霉素C 1.5～2mg/kg 腹腔注射一次；或环磷酰胺40mg/kg，腹腔注射，1次/d，连续5天。 试验设计 －剂量组 高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻 微中毒，体重略有下降，不引 起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组 接触途经 与实际接触途经一致或接近，可一次接触，也可每天接触一次，连续5天的方法。 取样时间 各组均于第一次接触后第12～14天将动物处死采样。 操作步骤 1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g） 2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污，转入另一小平皿中 。 3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～40min（低渗时间依室温条件而定）。 4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液10mL，固定20min。必要时可存放在冰箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，再加入新鲜固定液，固定10min。 5、软化 吸净固定液，加60％冰醋酸2mL，滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液，用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/ min离心10min。 6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.5～1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气干燥或微热烘干。 7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冲洗。晾干。 8、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中期相的细胞进行观察。 9．观察 每只动物分析100个中期分裂相细胞。 （1） 裂隙、断片、缺失、微小体、环状染色体、整倍体和非整倍体改变等。 （2）相互易位 涉及非同源染色体间末端断片的交换，需要两次断裂和修复。 （3）X-Y和常染色体的单价体 统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计分析。阳