HBVHEV二价抗原的载体构建及表达产物的生物学特性的研究.pdf

摘 要 为了预先了解由乙型肝炎的S蛋白和戊型肝炎的ORF2蛋白的 羧基末端中的414—606aa的组成的融和目的蛋白质的结构和性 质，以及为将来的实验做准备。我们通过相关在线网站和软件， 研究了目的蛋白的等电点；结构域；氨基酸组成；分子量；可溶 性：mRNA和蛋白质的二级结构；净电荷，亲水性和疏水性等，发 现融合蛋白质的结构和性质并不影响其作为二价疫苗的抗原，这 些预测结果为为我们将要进行的多项实验作好了必要的准备。 为构建一个能够表达出乙／戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆 菌高效表达载体。采用PCR方法扩增出S基因；采用PCR的方法 过T载体连接：菌落PCR；双酶切：southernblot：测序鉴定后， 将这两部分重组入含有Q增强子的pTQ-T7高效的E．coli表达 载体中。构建了pTQ-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。 这种方法为同时预防乙型和戊型肝炎提供了一个较好的途径。 为有效提高由乙型肝炎的S抗原基因和戊型肝炎的ORF2编码 区的羧基末端中的414—606aa的基因片段构建的高效表达载体 粒稳定性；葡萄糖浓度；PH值；IPTG浓度；转接量；诱导时间； 诱导温度；溶解氧对目的蛋白相对产量影响的研究，我们获得出 了较好的培养方法，使目的蛋白相对含量达48．23％；菌体干重达 0．59639／L。通过以上研究，可以为大规模的发酵工艺提供部分依 据。 利用乙型肝炎病毒adr亚型的S抗原基因和戊型肝炎病毒 China-D亚型的ORF2编码区的羧基末端中的部分序列的构建的载 体，在大肠杆菌中表达时，出现了大量包涵体，如何将包涵体进 行洗涤，变性，复性，纯化，以提高资源利用效率，降低成本， 提高产量，为进一步工业化生产疫苗用抗原作准备。我们以其为 对象，对包涵体进行洗涤，变性，复性，金属亲和层析柱和凝胶 过滤纯化后，蛋白的相对含量达98％。采用Westernblot和ELISA 对目的蛋白的活性进行检测，同时具有乙肝和戊型肝抗原活性。 为其工业化生产提供了实验依据。 关键词：HBV；HEV；Q增强子；基因重组基因工程；表达： 优化；发酵条件；二价疫苗；包涵体；变性；复性； 纯化。 knowthestructureandfeatureoffusion Inorderto S ofadr ofHBVand constructed protein by protein subtype in ofORF2 of some locatedc-terminalprotein sequences HEV for china—D of and subtype prepareexperiments，we researchPI ： structuredomain：aminoacid ：moleculeweigh；solubility：secondary composition structureof mRNAand ：net charge： protein andso ；hydrophilicityon，through hydro曲obicity find onlineinternetandsofeware．westructure pertinent andfeatureofthefusion cannotinfluenceits prote