本科生《P》第三章载体.ppt

拷贝数：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数量之比。一般寄主细胞只有一套染色体。 按照拷贝数的多少，可以将质粒划分为严紧型质粒和松弛型质粒。当拷贝数在1-10之间时，通常称为严紧型质粒。很多大质粒是严紧型质粒。当拷贝数多于10个时，通常称为松弛型质粒，小质粒一般是松弛型质粒。 严紧型质粒和松弛型质粒之间没有严格界限。 某种质粒对于某种寄主来说，拷贝数一般是一定的，拷贝数的存在是因为质粒上存在cop基因，它可以指令寄主细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数后，阻遏物也达到一定量，就阻遏质粒进一步复制。 按照是否含有trans基因将质粒分为结合型质粒和非结合型质粒。 Trans基因是一种可以指令寄主细胞产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使寄主细胞与其他细胞相接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞。我们把含有trans基因的质粒称为结合型质粒，把不含有trans基因的质粒称为非结合型质粒。 在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？ 质粒的命名：p，plasmid表示质粒，随后的两三个大写字母表示谁发现和发明了该质粒，数字表示质粒分离的次数或者构建的一系列质粒的编号。 例：pBR322 第三节 大肠杆菌的噬菌体载体（Bacteriophage vectors for use in E. Coli ) 一、噬菌体的定义（What are bacteriophages） 噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（viruses, “eater of bacteria”）。 2.λ噬菌体作为克隆载体的依据 ①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。 ②λ噬菌体可承载大的外源DNA。可承载的外源DNA为λDNA的75%-105%（即38-51kb）且λDNA上有20kb的区域对λ噬菌体并非必需，可取代或缺失。 3.λ噬菌体载体类型 λ噬菌体载体有两种类型，即插入型载体（Insertion vectors）和替换型载体（replacement vectors or substitution vector）。 二、凯伦噬菌体载体 三、M13噬菌体 M13噬菌体周期：  M13mp18 ① M13噬菌体通过鞭毛吸附，感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体的“+”链进入细胞内，以此为模板，复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为复制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制。 ② 当细胞内RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻止“+”链DNA的复制合成。结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新的“+”链DNA。 ③ 新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并不断挤出宿主细胞。 （ 单链，“+”链→存在于噬菌体中，双链DNA存在于宿主细胞中。 ） M13噬菌体周期的特点： ①增殖过程不会导致宿主细胞的溶菌生长，被感染的细胞一个世代可以释放1000个子代噬菌体。M13包装DNA分子的能力可达M13DNA本身的6倍。 ②制备的M13DNA，单、双链均可转染大肠杆菌受体细胞，因此M13DNA作为载体时，不必进行体外包装就可以直接转染受体细胞。 第四节 原核生物应用的其他载体 一、cosmid质粒载体 ①λ噬菌体特点：两端部少于280bp，且含有cos位点，可以插入36.4-51kb长度的DNA； ② 质粒克隆载体特点：不用包装即可转导。克隆能力一般不超过10kb，载体大小一般也在10kb以下，是环状双链DNA. cosmid质粒载体特点：将λ噬菌体载体的cos位点和质粒克隆载体相结合，大约4-6kb长，能够容纳47kb的外源DNA。 Cosmids: The vector be made up of plasmid sequences joined to the cos sites of phageλ, about 4-6kb in length, can accommodate cloned DNA fragments up to some 47kb in length. 二、噬菌粒载体 M13噬菌粒载体（ M13噬菌粒和质粒） 优点是可以用来制备克隆基因的单链DNA。 不足之处： A. 插入外源片段后，遗传稳定性下降，外源DNA越大越严重。 B．外源片段只按一种方向插入； C．接受外源DNA能力有限，小于1500bp。 噬菌粒载体特点： A. 分子量一般都比M13载体小，约3000bp，易于操作； B. 可得到10kb的外源DNA单链序列；？ C. 有质粒和噬菌体的复制起点，因此在大肠杆菌寄主中可以按正常双链质粒DNA分子形式复制；在有辅助噬菌体时可以按M13形式复制； D