副猪嗜血杆菌安徽株分型及其tbpA基因的克隆表达和免疫保护作用研究.pdf

摘 要 副猪嗜血杆菌 （Haemophilus parasuis, HPS ）是猪的革拉斯氏病（Glasser's disease ） 的病原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性 多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病，该病已经成为影响世界养猪业 的最重要的细菌性疾病之一，给养猪业造成了重大损失。目前HPS 已鉴定出15 个血 清型，但仍有大量的分离菌株无法定为任一血清型，同时各血清型之间缺乏有效的交 叉保护，这都制约了副猪嗜血杆菌病的有效防控及其疫苗的发展。 本研究对安徽地区HPS 分离株进行KRG 血清型和ERIC-PCR 、PCR-RFLP 基因 型分析，同时在预测HPS TbpA 蛋白抗原表位的基础上，将tbpA 分段克隆、表达与 鉴定，研究表达蛋白的免疫功能。本研究的主要目的是：(1)探讨安徽地区HPS 的血 清学和分子流行病学特点，为有效防控Glasser's disease 提供科学依据；(2)探讨TbpA 蛋白在 HPS 免疫过程中的作用，为寻找制备高效广谱 HPS 新疫苗的途径提供理论 依据。 实验一、HPS 安徽分离株KRG 血清型及ERIC-PCR 、PCR-RFLP 基因型多态性研究 自安徽省 12 个地区（或猪场）的发病猪（高热、呼吸困难）分离鉴定了 18 株 HPS ，采用KRG 、ERIC-PCR 、PCR-RFLP 对其进行血清型和基因型分析。 结果显示，18 株HPS 中有10 株可以确定血清型，其中以血清型4 型最为流行， 占27.78% （5/18 ），其次为14 型和 13 型分别占 16.67% （3/18 ）和 11.11% （2/18 ）， 此外尚有44.4% （8/18）的菌株不能进行定型。ERIC-PCR 将 18 株HPS 分为11 个基 因型，其中IV 为优势基因型，占27.78% （5/18 ），其次是II 基因型和I 基因型，分 别占16.67% （3/18 ）和11.11% （2/18 ）；PCR-RFLP 将 18 株HPS 分为6 个基因型， 其中优势基因型为DBP 、BAE 和BBB ，分别占44.44% （8/18 ）、22.22% （4/18 ）和 16.67% （3/18 ）；不能进行血清学分型的菌株均得到有效的基因分型。 结果表明，HPS 在安徽地区猪群中普遍存在，血清型、基因型均呈多态性分布， HPS 的KRG 血清型、ERIC-PCR 基因型、PCR-RFLP 基因型三者之间均无明显的相 关性，而ERIC-PCR 基因型与同一血清型菌株的来源相关，更能反映菌株的亲缘关系， 从分子水平上揭示不同菌株的遗传距离，尤其是应用于病原在猪场的场内及场间的流 行情况研究。 实验二、HPS tbpA 基因的克隆、表达及其免疫保护作用的研究 参照GenBank 上登陆的HPS SH0165 株tbpA 基因序列，设计一对特异性引物， 采用PCR 方法扩增HPS(LJ3 株) 的tbpA 基因，并预测其信号肽序列及主要的抗原表 位，以不破坏其优势抗原表位的原则，将tbpA 基因分为三段，分别设计引物，经PCR 扩增后克隆到pET-32a （+ ）表达载体中，成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-tbpA1、 I pET-32a(+)-tbpA2 和pET-32a(+)-tbpA3，转化BL21 后进行诱导表达，经 SDS 电泳可见大小分别为62 kD、54 kD、44 kD 的目的蛋白。三段重组蛋白经免疫印记检 测后显示其均具有免疫反应性，能与兔抗HPS （LJ3 株）高免血清发生特异性反应。 将三段重组蛋白及HPS （LJ3 株）甲醛灭活菌体分别免疫小鼠后，用同源菌株对菌体 免疫组、三个重组蛋白免疫组及对照组小鼠腹腔攻毒，菌体免疫组及 TbpA1 能分别 提供 40%及 20% 的免疫保护率，而其他蛋白免疫组及对照组全部死亡。抗体杀菌试 验结果同样表明，TbpA1 蛋白的抗体具有杀菌作用。实验结果表明重组的TbpA1 蛋 白具有抗感染保护作用。 关键词：副猪嗜血杆菌，转铁结合蛋白A ，分型，克隆表达，免疫