实验动物皮肤病原真菌分子生物学检测方法的建立及其应用.pdfVIP

中文摘要 实验动物皮肤病原真菌分子生物学 检测方法的建立及应用 摘 要 目的：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔等作为实验动物，已广 泛应用于科研、教学和生产实践中。三种致病性皮肤真菌： canis)、石膏样小孢子菌 犬小孢子菌(Microspomm 须毛癣菌 (Microsprumgypseum)、 从动物皮肤病灶处或从非病灶处分离到这三种菌，均视为异 常。因为非病灶处的真菌很可能随后引起实验动物的皮肤 病，并有可能造成饲养和实验人员的感染。 目前该病的实验室诊断主要依赖于形态学观察(直接镜 检及真菌培养)，但所需时间长，且不易鉴定到种的水平， 尤其需要较长的工作经验，因而不能满足实验动物快速、准 确检测的需要。近年来，分子生物学方法开始应用于真菌学 研究方面，如RFLP、分子杂交、DNA序列分析等，特别是 任意引物聚合酶链式反应(AP—PCR)，有力地促进了皮肤病 原真菌检测的发展。本研究将皮肤病原真菌通用引物PCR 与AP．PCR技术相结合，应用于实验动物皮肤病原真菌的检 测，使真菌的表型鉴定转向基因型鉴定，以达到快速准确检 测实验动物皮肤病原真菌的目的。 方法：1标准菌株的DNA提取及PCR扩增：取标准菌株 犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌传种至沙氏斜面固 体培养基，27℃培养7天。无菌条件下各取少量以上三种培 中文摘要 养物，接种于沙氏液体培养基，置27℃恒温摇床80转／分振荡 培养10天。将培养液倒入100ml离心管内离心，沉淀装入1．5ml Ep管中，．70℃或液氮保存。取以上冷冻保存的三种菌沉淀 物少量(各约1 Omg)用破壁酶破壁，使用酚氯仿抽提法抽提 11 11 DNA；然后用皮肤病原真菌通用引物(CHSS，CHSR)和 随机引物(FMl)进行PCR扩增，鉴别三种皮肤真菌标准菌 株。 2通用引物PCR特异性及敏感性测定 特异性测定：用皮肤病原真菌通用引物进行PCR，扩 增大肠杆菌DNA(化学裂解法提取)、犬肝炎病毒DNA及 小鼠肝癌H22细胞DNA(由本室提供)。 敏感性测定：DNA提取方法同上，以紫外分光光度法 O倍系列 测定DNA质量浓度，根据测定值将DNA进行1 质量浓度稀释，得到100ng一10龟的8个质量浓度，然后对 其进行PCR扩增。 3皮肤病原真菌动物模型的建立：取三种标准菌株传种 到沙氏斜面固体培养基，27℃培养1O天。取下菌落加适量灭 菌生理盐水制成菌悬液，用划痕法建立实验动物皮肤病原真 菌动物模型。 4使用分子生物学方法及传统方法检测皮肤病原真菌： 用接种铲从建立的动物模型身上刮取毛发及鳞屑于沙氏斜 面固体培养基上培养，2～3天后菌落长出，从培养基上刮取 菌落提取DNA及用通用引物PCR扩增鉴别，同时将可疑菌落 分离纯化，6～7天后用随机引物FMl进行PCR扩增鉴别，12～14 天后根据镜检及菌落形态鉴别皮肤病原真菌。 5河北省各地实验动物的皮肤病原真菌检测：从实验动 中文摘要 得到大小分别为1 三种标准菌株相比，有明显差异。此菌经过分离纯化培养， 开始为白色菌落形似须毛癣菌，8天后出现灰色菌毛，与三 种标准菌株形态差异显著。鉴定其为皮肤病原真菌，但不 在三种实验动物皮肤病原真菌之列。 结论 11 11 l皮肤病原真菌通用引物(CHSS，CHSR)具有较 强的特异性。将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP．PCR技术相 结合，可快速、准确鉴别实验动物皮肤病原真菌。 2实验验证皮肤病原真菌通用引物PCR检测敏感度为 lOO龟。 3通过“划痕法’’，使用经过固体