《PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法 Detection of Viable Bacterium Cells Based on Propidium Monoazide in Combination with PCR》.pdfVIP

华南理工大学学报(自然科学版) JournalofSouthChina of V0l。38No．9 第38卷第9期 UniversityTechnology Science 2010 2010年9月 (Natural Edition) September PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法木 罗剑飞 林炜铁 郭勇 (华南理T大学生物科学与工程学院，广东广州510006) 摘要：基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态， 这会导致对细菌数量的错误估计．文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前 处理，使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联，并抑制该DNA分子的PCR扩增． min时，PMA可抑制细 结果表明：当样品中PMA质量浓度大于3／乩g／mL、曝光时间大于3 PCR扩增。而当浊度大于100NTU时，PMA失去效果． 关键词：叠氮溴化丙锭；脱氧核糖核酸；聚合酶链反应；活细胞检测 中图分类号：Q7；Q89 叠氮溴化丙锭(PMA)和叠氮溴化乙锭(EMA)死细胞DNAPCR扩增的最适浓度、曝光时间及浊 是两种对DNA具有高度亲和力的光敏DNA染料，度对PMA交联的影响． 不能透过完整的细胞膜，只能选择性地修饰细胞死 1材料与方法 亡后暴露出来的DNA分子．用PMA和EMA处理后 的样品暴露于强光下时，PMA和EMA所带的光敏 1．1 菌种、试剂与仪器 性稷氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合 coliATCC 实验用菌株大肠杆菌Escherichia 位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮 8739购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，采用 碳键，致使DNA分子的永久修饰，最后阻断DNA分 LB液体培养基于30℃、160r／min下培养24h． 子的聚合酶链式反应(PCR)扩增；同时，那些留在溶 液中没有与DNA分子进行交联的PMA和EMA在 7 (5 强光照射的同时与水分子反应生成没有活性的羟 胺¨J．EMA结合的PCR技术和各种分子诊断技术 俊生物技术有限公司合成；脱氧核糖核酸(dNTPs)、 能定量检测和分析样品中的微生物的活细胞，是分 析检测环境中微生物的有效方法，在临床诊断、食品 Doe 2000型凝胶成像系统购 安全检测及环境微生态学研究中得到了广泛的 自Eppendorf公司；Gel 应用‘2·4|． 自BIO．RAD公司． 由于EMA的细胞毒性…，其应用受到较大的 1．2 方法 1．2．1 实验样品 限制．因此，本研究将无