人羊膜间充质干细胞体外构建组织工程角膜上皮层的实验研究.pdf

史堡苤墅堕型盘查!!!!生!!旦笙!!鲞筮!!塑 ·99l· 璺!!!!!!￡QP!些生竺!!!堕!兰里!!!!!!!!∑!!：!!!堕!：!! ·实验研究· 人羊膜间充质干细胞体外构建组织工程角膜 上皮层的实验研究 肖盼 陈剑 【摘要】 背景 目前角膜移植手术是治疗严重角膜病变的主要方法，角膜供体来源的匮乏限制该疗法 的应用。组织工程角膜为角膜疾病的治疗开辟了新的途径。 目的 探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)构 cmx6 建组织工程角膜上皮层的可能性。 方法 新鲜羊膜组织剪成6 cm大小的组织块后用胰蛋白酶+EDTA 消化液消化，将人羊膜上皮细胞(AECs)刮除干净，然后将羊膜组织剪碎，用胶原酶Ⅱ进行消化，分离原代 hAMSCs并进行培养。分离新西兰白兔的角膜基质片后按随机数字表法分为2个组，实验组将培养至第3代 的hAMSCs以l×105／ml的密度种植于去角膜上皮细胞的兔角膜基质片上进行培养，空白对照组为不种植细 胞的空白角膜基质片。待细胞达80％～90％融合时再将兔角膜基质片移至插入式培养皿中进行气液界面诱 导分化培养，培养至14d时将兔角膜基质片在质量分数4％多聚甲醛中固定，制备组织切片，行苏木精一伊红 染色，观察兔角膜基质片的形态。采用免疫组织化学染色和免疫荧光技术检测兔角膜基质片上诱导分化的 hAMSCs中细胞角蛋白3(CK3)和CKl2的表达。结果实验组hAMSCs种植于去角膜上皮细胞的兔角膜基 质片上气液界面培养14d后可形成3～5层的复层细胞，可见兔角膜基底膜的hAMSCs细胞核呈椭圆形，表层 的hAMSCs细胞核呈长梭形，形态与正常角膜上皮层相似；而空白对照组兔角膜基质上无细胞生长。免疫组 织化学染色显示兔角膜基底膜上的hAMSCs对CK3、CKl2呈阳性反应，为细胞质中棕黄色染色，而阴性对照 组未见CK3、CKl2染色。免疫荧光检测显示兔角膜基底膜上的hAMSCs细胞质中可见CK3、CKl2呈绿色荧 光，而阴性对照片细胞质荧光缺失。 结论hAMSCs在兔角膜基质片气液界面上可成功诱导分化为角膜样 上皮细胞。 【关键词】 羊膜；间充质干细胞；细胞培养；组织工程；角膜上皮；分化；人 in Constructionof corneal humanamniotic stemcells tissue·engineeredepitheliumbyculturing mesenchymal vitroXiao No．2 Pan．Chen 215500， Jian．DepartmentofOphthalmology，ChangshuPeople’sHo印ital，Changshu China author：Chen Corresponding Jian，Email：drchenj@163．corn treatmentto corneal the Corneal isaneffective severe diseases，but [Abstract】 transplantation Background ofcorneadonorlimitsits corneais anew tocornealdiseases． shortage application．Tissue—en