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Western Bloting 实验技术 汇报人：杨华永 2013-11-26 目录 Bloting分类 1 实验原理 2 实验方法 3 问题分析 4 几种Blotting ： blotting（印迹法）: 是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Southern Blot: 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法。 Northern Blot: 对RNA的印迹分析。 Western Blot: 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析。 Eastern Blot: 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析。 Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触 外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触 Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开 电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳 小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开 蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动 标本加入到上样孔中 Western Blot基本原理 Western Blot 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体（NC膜、PVDF膜），然后用这种多肽的特异抗体作为探针，对靶物质进行鉴别和定量。 检测方法有放射性标记、酶标化学显色或酶标化学发光等。酶标化学发光法以其高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优于酶标化学显色法。 可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。  Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳(1.0h + 2.0h) 转膜(1-2h) 封闭(1h) 一抗杂交(0.5h+1h/过夜) 二抗杂交(0.5h+1h) 底物显色(0.5h+0.5h) 一、蛋白样品的制备: 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶上样缓冲液裂解。 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。 培养的细胞： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍。 ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~30min。 ⑶ 用细胞刮刀刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷ 12000rpm离心，4℃，5min。 ⑸ 取少量上清进行蛋白定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合后加loading buffer，98℃，3-10min蛋白变性，剩余溶液-80℃存。 哺乳动物组织总蛋白提取： 蛋白样品的定量——BCA法 Cu2+ Cu+ BCA 络合物 紫 色 OD 562nm OH— Protein 二、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 三、转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 膜的种类和区别 四、封闭 20%BSA 脱脂奶粉（5％） 0.2%Tween-20 Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 0.25%Gelatin 五、一抗、二抗孵育 抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。 六、二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 辣根过氧化物酶-DAB法:①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应. 化学发光显色法(HRP) 辣根过氧化物酶-ECL法:增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来。 七、膜再生 如前次杂交结