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第七章 细胞培养中的基本方法 　 一、细胞培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成败的首要条件。 培养前准备 准备各种所需物品（宁多勿少）: 用品置于场地，然后消毒 操作区域的消毒 现多用紫外线灯灭菌，效果很好。 洗手和着装 洗手用75%酒精或0.2%的新洁尔灭 火焰消毒 　 在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时， 首先要点燃酒精灯。以后一切操作,如安装吸 管帽、启开或封闭瓶口等，都需要经过火焰 烧灼进行。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼，否则 会烧焦形成炭膜，再用时会将有害物质带入培养液。　 培养操作: 动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。 防止各种用液的交叉污染 不向操作野讲话或咳嗽 二、细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是 目前采用的最普遍的方法。 　　　血细胞计数板人工计数 　　　 细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽 巴氏(Neubauer)血细胞计数板。 具体操作程序如下： 1、取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净,将盖玻片放于计数板上。 2、用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后进行计数。 3、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。 对压边线细胞*：计上不计下，计左不计右 计算：一般以每毫升含细胞数来表示 大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所 以计算公式为： 细胞悬液的细胞数）/ml 　＝（?四个大格子细胞数/4)?×104? 计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须 稀释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。 每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 用细胞计数板计数时应注意的事项: ﹙1﹚不要漏计，不要重复 ﹙2﹚细胞悬液应混合均匀 ﹙3﹚浓度不可过高也不可过低。 三、细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。 它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。 实验原理： 细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后经过不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为准确描述整个过程中细胞数目的变化，须对细胞进行连续计数。通常计数7天。 典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期*，成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。 仪器: 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度） 玻璃器皿: 1. 吸管（弯头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 塑料器皿 1. 吸头\枪头 2. 24孔培养板 其他物品 1. 微量加样器 2. 血球计数板 试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. RPMI1640 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 0.25%胰酶 制作方法： 1.培养细胞 首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0小时。 2.计数细胞密度 从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。 3.绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。 注意事项: 1．?细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够 精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分 析。2．?现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线 测