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附件6禽流感病毒通用荧光rt-pcr检测.-.2008108102742.doc
附件6
禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测
1 材料与试剂
1.1 仪器与器材
荧光RT-PCR检测仪
高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)
台式离心机(离心速度3000r/min)
混匀器
冰箱(2~8℃和-20℃两种)
微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头
Eppendorf管(1.5mL)
1.2 试剂
除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
氯仿;
异丙醇:-20℃ 预冷;
PBS:121±2℃,15min高压灭菌冷却后,无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 U/mL;
75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水(符合GB 6682 要求)配制,-20℃预冷。
禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒:组成、功能及使用注意事项见附录。
2 抽样
2.1 采样工具
下列采样工具必须经(121±2)℃,15min高压灭菌并烘干:
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5ml Eppendorf管、研钵。
2.2 样品采集
1)活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:
取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3-5次取咽喉分泌液;
取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便;
将拭子一并放入盛有1.0mL PBS的1.5mL Eppendorf管中,加盖、编号。
2)肌肉或组织脏器
待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器,编号,送实验室。
3)血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中,编号备用。
2.3 样品贮运
样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封,送实验室。
2.4 样品制备
1)咽喉、泄殖腔拭子
样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,室温放置30 min,取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中,编号备用。
2)肌肉或组织脏器
取待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mL PBS混匀,4℃,3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中,编号备用。
2.5 样本存放
制备的样本在2~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70℃以下,但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。
3 操作方法
3.1 实验室标准化设置与管理
禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的实验室规范。
3.2 样本的处理
在样本制备区进行。
⑴ 取n 个灭菌的1.5mL Eppendorf管,其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出),编号。
⑵ 每管加入600μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL,一份样本换用一个吸头,再加入200μL氯仿,混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。
⑶ 取与⑴相同数量灭菌的1.5mL Eppendorf管,加入500μL异丙醇(-20℃预冷),做标记。吸取本标准⑵各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500μL,不能吸出中间层,颠倒混匀。
⑷ 于4℃、12 000r/min离心15 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干);加入600 μL 75%乙醇,颠倒洗涤。
⑸ 于4 ℃、12000 r/min离心10min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
⑹ 4000 r/min 离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩到管底部,小心倒去上清,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥3 min,不能过于干燥,以免RNA 不溶。
⑺ 加入11 μL DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA, 2000r/min离心5s,冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增;若需长期保存须放置-70℃冰箱。
3.3 检测
⑴ 扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶,在室温下融化后,2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和,每个样品测试反应体系配制如下:RT-PCR反应液15μL,Taq酶0.25μL。根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,加入到适当体积中,向其中加入0.25×n颗RT-PCR反
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