附件6禽流感病毒通用荧光rt-pcr检测.-.2008108102742.doc.doc

附件6 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测 1 材料与试剂 1.1 仪器与器材 荧光RT-PCR检测仪 高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上） 台式离心机（离心速度3000r/min） 混匀器 冰箱（2～8℃和-20℃两种） 微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头 Eppendorf管（1.5mL） 1.2 试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。 氯仿； 异丙醇：-20℃ 预冷； PBS：121±2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 U/mL； 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB 6682 要求）配制，-20℃预冷。 禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项见附录。 2 抽样 2.1 采样工具 下列采样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干： 棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5ml Eppendorf管、研钵。 2.2 样品采集 1)活禽 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3-5次取咽喉分泌液； 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； 将拭子一并放入盛有1.0mL PBS的1.5mL Eppendorf管中，加盖、编号。 2)肌肉或组织脏器 待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。 3)血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 2.3 样品贮运 样品采集后，放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。 2.4 样品制备 1)咽喉、泄殖腔拭子 样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。 2)肌肉或组织脏器 取待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，4℃，3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。 2.5 样本存放 制备的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 3 操作方法 3.1 实验室标准化设置与管理 禽流感病毒通用荧光RT－PCR检测的实验室规范。 3.2 样本的处理 在样本制备区进行。 ⑴ 取n 个灭菌的1.5mL Eppendorf管，其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号。 ⑵ 每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头，再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。 ⑶ 取与⑴相同数量灭菌的1.5mL Eppendorf管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取本标准⑵各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀。 ⑷ 于4℃、12 000r/min离心15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入600 μL 75％乙醇，颠倒洗涤。 ⑸ 于4 ℃、12000 r/min离心10min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 ⑹ 4000 r/min 离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA 不溶。 ⑺ 加入11 μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA， 2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。 3.3 检测 ⑴ 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制如下：RT-PCR反应液15μL，Taq酶0.25μL。根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积中，向其中加入0.25×n颗RT-PCR反