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乳源蛋白的elsa检测技术研究
乳源蛋白的ELISA检测技术研究
摘要
针对乳品掺假的各种检测方法的研究是控制乳品品质的一个关
键点,本课题针对牛乳中乳源蛋白,研究建立酶联免疫吸附(ELISA)
建立直接竞争法,及针对牛乳1(.酪蛋白(K.CN)建立间接竞争法和
间接法,通过检测牛乳中乳源蛋白含量来分析牛乳中掺假情况。
牛乳主要蛋白成分的分离制备:采用凝胶过滤色谱纯化得到浓
l
度为0.3
O%和6.03%。
和1.808mg/mL的牛乳D一和1C—CN,得率分别为2.1
分别免疫新西兰大白兔,收集高效价血清,采用饱和硫酸铵分步盐
析和蛋白A亲和色谱纯化;用K—CN免疫产蛋鸡,收集高免鸡蛋,采
用水稀释、膜微滤超滤、盐析和亲和色谱纯化。得到纯化0【.LA—IgG,
0。574mg/mL,0.5014mg/mL,0.5
达90%。
牛乳蛋白抗原的酶标记技术研究:对抗原蛋白进行酶标记是建
碘酸钠氧化法对仅.LA、D一及1c.CN分别进行标记,结果显示,HRP
率33.6%,标记率108.1%),所制得的酶标抗原的效价也较高均可
达1:640。该法标记前两种抗原的酶结合率及标记率等指标较为合
适,而1c—CN的酶标记物各指标均较低(酶结合率均低于2.2%,标
记率最高为66.2%)。
牛乳蛋白检测的ELISA方法是课题的重点,实验了以下方法:
被抗体最佳浓度(anti.Q—LA
180及anti.B.CN1:160)、封
IgG IgG
h)、酶标抗原稀释
闭液体积及封闭时间(200}tL,1%明胶,封闭1
度(HRP。11.LA 1:1 O
l:20及HRP.B.CN0)和待测牛乳样品稀释度(1:1
及1:40)、底物最佳反应时间(25min,37。C)等对竞争ELISA效果
有重要影响的因素;
度为l:640(起始浓度为1
mg/mL),原料乳待测样品稀释度为
1:1
0240,抗体与待测样品板外反应时间为30min;
度均为1:1O(起始浓度为1
mg/mL),原料乳待测样品稀释度为
1:3200;
经过重复性试验及敏感性试验表明,本课题建立的检测牛乳
为5%及6%。建立的检测牛乳1c.CN的间接竞争ELISA法的对三聚
氰胺最低检出限为5%。变异系数均小于5%。以上方法均具有简单
快速的特点。
关键词:牛乳蛋白质检测,0【一乳白蛋白(0【一LA),p一酪蛋白(p-cn),
Ⅱ
DETECTINGBASEDoN
ELISA SYSTEM
BoⅥNEMILKPRoTEIN
ABSTRACT
the
detectionmethodsis critical tocontrolthe
adultery
Developing point
of ELISAmethodswere established
qualitvdairyproducts.Ⅱlerefore being
basedon
bovine
proteins,including
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