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乳源蛋白的elsa检测技术研究

乳源蛋白的ELISA检测技术研究 摘要 针对乳品掺假的各种检测方法的研究是控制乳品品质的一个关 键点,本课题针对牛乳中乳源蛋白,研究建立酶联免疫吸附(ELISA) 建立直接竞争法,及针对牛乳1(.酪蛋白(K.CN)建立间接竞争法和 间接法,通过检测牛乳中乳源蛋白含量来分析牛乳中掺假情况。 牛乳主要蛋白成分的分离制备:采用凝胶过滤色谱纯化得到浓 l 度为0.3 O%和6.03%。 和1.808mg/mL的牛乳D一和1C—CN,得率分别为2.1 分别免疫新西兰大白兔,收集高效价血清,采用饱和硫酸铵分步盐 析和蛋白A亲和色谱纯化;用K—CN免疫产蛋鸡,收集高免鸡蛋,采 用水稀释、膜微滤超滤、盐析和亲和色谱纯化。得到纯化0【.LA—IgG, 0。574mg/mL,0.5014mg/mL,0.5 达90%。 牛乳蛋白抗原的酶标记技术研究:对抗原蛋白进行酶标记是建 碘酸钠氧化法对仅.LA、D一及1c.CN分别进行标记,结果显示,HRP 率33.6%,标记率108.1%),所制得的酶标抗原的效价也较高均可 达1:640。该法标记前两种抗原的酶结合率及标记率等指标较为合 适,而1c—CN的酶标记物各指标均较低(酶结合率均低于2.2%,标 记率最高为66.2%)。 牛乳蛋白检测的ELISA方法是课题的重点,实验了以下方法: 被抗体最佳浓度(anti.Q—LA 180及anti.B.CN1:160)、封 IgG IgG h)、酶标抗原稀释 闭液体积及封闭时间(200}tL,1%明胶,封闭1 度(HRP。11.LA 1:1 O l:20及HRP.B.CN0)和待测牛乳样品稀释度(1:1 及1:40)、底物最佳反应时间(25min,37。C)等对竞争ELISA效果 有重要影响的因素; 度为l:640(起始浓度为1 mg/mL),原料乳待测样品稀释度为 1:1 0240,抗体与待测样品板外反应时间为30min; 度均为1:1O(起始浓度为1 mg/mL),原料乳待测样品稀释度为 1:3200; 经过重复性试验及敏感性试验表明,本课题建立的检测牛乳 为5%及6%。建立的检测牛乳1c.CN的间接竞争ELISA法的对三聚 氰胺最低检出限为5%。变异系数均小于5%。以上方法均具有简单 快速的特点。 关键词:牛乳蛋白质检测,0【一乳白蛋白(0【一LA),p一酪蛋白(p-cn), Ⅱ DETECTINGBASEDoN ELISA SYSTEM BoⅥNEMILKPRoTEIN ABSTRACT the detectionmethodsis critical tocontrolthe adultery Developing point of ELISAmethodswere established qualitvdairyproducts.Ⅱlerefore being basedon bovine proteins,including

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