人乳铁蛋白基因胡萝卜(daucus carota l.)中的表达及其功能研究.pdfVIP

摘 要 乳铁蛋白是一种糖蛋白，为转铁蛋自家族的一员，在人和哺 乳动物的许多器官与组织中广泛分布。乳铁蛋白具有多种生物学 功能，这些功能包括：促进人体肠道对铁的吸收及调节体内铁的 平衡：广谱抗菌(细菌和真菌)、抗病毒感染作用等。把人乳铁蛋 白基因转入富含类胡萝b素和植物纤维的胡萝b，让它合成具有 生物活性的人乳铁蛋白，相当于在营养丰富的胡萝b中添加新的 营养保健因子。乳铁蛋白强的铁螯合能力和广谱抗菌、抗病功能， 可提高转基因胡萝h铁的含量，增强胡萝p抗菌、抗病能力。 本研究在对胡萝h组织培养及遗传转化体系进行优化的基础 上，构建了人乳铁蛋白基因植物表达载体，在农杆菌介导下，首 次把人孚L铁蛋白基因导入胡萝b，获得了转基因植株。对转基因 植株进行分子检测，证实了外源基因已整合到胡萝卜基因组中。 功能研究和成分测定表明，转基因胡萝b具有抗菌活性，其铁含 量也得到提高。具体结果如下： 1．建立了高效的胡萝b组织培养及再生体系 以适于生产饮料的胡萝b“新黑田五寸人参”为材料，研究 不同外植体、不同培养基，不同培养条件对胡萝b愈伤诱导及再 生的影响，建立一套高效的胡萝b组织培养再生体系：最适于诱 导愈伤的外植体是弱光或黑暗下发芽7．10d无菌苗下胚轴，最适合 的愈伤诱导培养基和继代培养是B5C(B5+O．5mg／L 6BA+0．5mg／L 2,4-D)，最适于植株再生的培养基为不添加任何激素的B5或MS， 组织培养条件为25℃、光照周期为16hr／Shr。适当照射目光对植株 再生具有很好的促进作用。 2．建立了高效的遗传转化体系 DApBll2I和pTOK233为转化质粒，在农杆菌LBA4404介导下， 对胡萝h遗传转化体系进行系统研究，首次为该胡萝b品种建立 一套高效的遗传转化体系，结果为：最适转化受体为新鲜下胚轴 uM) 及经预培养的下胚轴；共培养时，低浓度的乙酰丁香酮(25 对转化具有促进作用：适宜的卡那霉素筛选浓度是100mg／L。筛选 时，卡那霉素浓度先低后高，植株再生时完全去除，有利于缩短 植株再生周期。 3．入乳铁蛋白基因在胡萝p中的转化及分子检测 以pBIl21为中间载体，把人乳铁蛋白基因替换NGUS位置上， 构建成表达载体pBIhLF。在农杆菌LBA4404介导下，把目的基因 导入胡萝h，获得了外表正常的抗性植株。PCR检测、Southern杂 交证实了外源基因己整合到抗性植株基因组DNA中。对转基因植 株进行RT，PCR检验，得到了阳性结果，说明外源基因在胡萝h中 能正常转录。 4．转基因植株抗菌能力加强，铁含量得到提高 提取转基因植株叶片粗蛋白，以大肠杆菌DH5n和酵母菌 AHl09为试验靶标，测定了转基因植株粗蛋白的抑菌活性。结果表 明，转基因植株叶片相蛋白对DHS；Ⅱ有强烈的抑制作用(当培养基 中粗蛋白为lmg／ml时，每m1菌数为对照的1．47％)，对AHl09的抑 制作用较弱。按GB／T 13883—92标准测定了部分转基因植株叶片中 铁含量。在测定的植株中，铁的含量都得到提高，其中一株提高 64％。 关键词：人乳铁蛋白基因，遗传转化，胡萝b，抗菌活力， 铁含量 Abstract memberoftransferrin amultifunctional Lactoferrin，a family，is functionstestifiedinclude：enhance biological iron glycoprotein．The Of assimilationof cellintestineand jron ion epithelial equilibrat