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斑点杂交法检测SEN病毒感染 作者：杨群，田德英，许东，葛娅，任星峰，宋佩辉 【关键词】 聚合酶链反应 　　【Abstract】 AIM: To explore the availability of dotblot assay in the detection of SEN virus infection. METHODS: Nuclear acid was extracted from serum specimens, and dotblot analysis and polymerase chain reaction(PCR) were carried out respectively to detect SENV DNA. RESULTS: Among 191 samples, 6 were found positive by dotblot, and 11 were found positive by PCR. CONCLUSION: The probe prepared by us is SENVspecific. Dotblot hybridization with DIGlabeled SENV DNA probe can be used to detect SENV DNA in sera samples. 　　【Keywords】 SEN virus; dotblot; polymerase chain reaction 　　【摘要】 目的： 探讨斑点杂交法检测SEN病毒（SENV）感染的应用价值. 方法： 应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENV DNA，与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较. 结果： 在191份血清中，采用斑点杂交法检出6份阳性，检出率为3.1%. PCR方法检测出11份阳性，阳性率5.8%. 结论： 制备的地高辛探针具有SENV特异性，以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染. 　　【关键词】 SEN病毒；斑点杂交；聚合酶链反应 　　0引言 　　目前，国外对SENV基因组研究表明，SENV可分为SENVA至SENVH 8个亚型，各亚型间基因序列差异在15%~50%之间，各亚型与TTV原型株间基因序列差异为40%~60%［1］. 尽管国内外学者对SENV感染进行了不少报道，但是仍然没有给出SENV的感染复制场所的直接证据［2，3］. 我们进行了地高辛标记SENV探针的研究并评价其对SENV DNA直接检测的应用价值. 　　1材料和方法 　　1.1材料系1997/1998收集的191例不同人群血清标本，包括慢性乙型肝炎患者、重症肝炎患者、非甲~非戊肝炎患者、血浆置换患者、静脉吸毒者和正常人群. 所有血清样本采集后于-70℃冰箱保存. 　　1.2方法 　　1.2.1SEN病毒核酸探针的制备选择SENV开放阅读框2(ORF2)4区域设计、由上海博亚生物技术服务有限公司合成引物. 外引物为: Sense primer: 5′GAGTTTACACACCGCAG3′ Antisense primer: 5′ GTCTTATGTACCGTCTCC3′；内引物为： Sense primer: 5′GGTGGCACGGGATCCAAAAATGCACTTTTC3′ Antisense primer: 5′GGTGGCACG GATCCTAAAAATGCACTTTTC3′. 通过套式PCR反应从患者血清中扩增得到长511 bp片段，连接pRSETB载体，转化大肠杆菌. 在挑取阳性克隆提取重组质粒进行测序鉴定后扩增重组质粒，以BamHⅠ单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，取1 μg以博士德公司地高辛DNA标记和检测试剂盒进行标记，操作按试剂盒说明书进行. 　　1.2.2血清样品DNA的提取病毒核酸抽提试剂为美国Biotronics公司Acupure DNA/RNA提取试剂盒,取50 μL血清加100 μL裂解液充分混匀，80℃温浴10 min,取出室温平衡5 min，加150 μL异丙醇混匀，经15 000 g 10 min离心沉淀，去除上清液，加50 μL 700 mL/L乙醇试剂洗涤沉淀,再离心去除上清液，室温风干，加50 μL样品稀释液重悬样品，80℃温浴5 min,离心后将上清液备用. 　　1.2.3PCR检测取各份提取核酸5 μL作为模板加入第1次PCR反应体系. 50 μL反应体系中镁离子终浓度为15 mmol/L, dNTP终浓度各为200 μmol/L, Taq P为2 u，外引物各为50 pmol，以9