重组干酪乳杆菌泌表达猪轮状病毒vp4蛋白和vp4-ltb融合蛋白及其免疫效果分析.pdfVIP

摘要 摘要 猪轮状病毒(PorcineRotavirus，PRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起仔猪病 毒性腹泻的主要病原之一。该病是典型的粪一口传染，针对其黏膜感染特点，研制有效的 刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进一步引起全身性系统免疫反应的疫苗，对该病的防 治具有重要意义。LTB为大肠杆菌不耐热肠毒素的结合亚单位，无毒素活性，可以与多种蛋 白抗原或非蛋白抗原经不同免疫途径共同免疫机体，可增强机体的系统免疫及黏膜免疫应 答，同时，还能消除机体对免疫原的耐受，诱发长期免疫记忆。 本研究以猪轮状病毒感染与免疫特点和乳酸菌的肠道益生作用、佐剂效应、非特异性抗 caseiATCC393(L．easel393)作 菌、抗感染特点，设计利用干酪乳杆菌Lactobacillus 菌不耐热肠毒素的B亚单位相连接)为目的基因，插入到分泌表达型的乳酸杆菌中，构建表 达了猪轮状病毒主要免疫保护性抗原VP4的重组干酪乳杆菌表达系统和共表达VP4一LTB的重 组干酪乳杆菌表达系统，分析比较了这两种重组干酪乳杆菌的免疫原性。 达位点及干酪乳杆菌密码子使用的偏嗜性，应用oli906．0软件设计引物P卜P2，经PCR扩 增出约756bp的目的基因VP4，将VP4基因片段克隆到pMDl8一Tsimple载体，并进行了酶切、 393， 收目的基因片段VP4与经同样双酶切的表达载体pPG一2连接，电转化感受态厶caseJ 筛选阳性克隆，并进行酶切、PCR和测序鉴定，重组质粒命名pPG一2一VP4，重组干酪乳杆菌 VP4-LTB，再将其与pMDl8-Tsimple载体链接，并进行酶切、PCR鉴定和序列测定筛选出阳 393， VP4 LTB／L．casel393。 鉴定后重组质粒命名pPG-2一VP4一LTB，重组干酪乳杆菌命名为pPG…2 将获得的两种重组干酪乳杆菌以2％乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。重组干酪乳 蛋白的大小与理论值相符。Westernblot结果分析表明，表达的蛋白可被PRV抗血清所识别， 间接免疫荧光实验结果表明，所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到：为了证明两 株重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值，以及LTB的粘膜免疫作用，本实验以 BALB／c小鼠为试验动物，进行免疫学实验。免疫程序为：实验鼠口服接种109活菌量，每隔 2w免疫一次，共免疫三次，每次连续免疫3d，一天免疫一次。同时，以口服空载体干酪乳 杆菌为阴性对照。免疫后分别测定了小鼠粪便、阴道粘液、泪液、乳汁样品中抗VP4分泌型 IgA及小鼠血清样本中抗VP4的特异性I酊水平。ELISA检测结果表明，口服免疫重组干酪 乳杆菌后在小鼠粪便、阴道黏液、泪液、乳汁中均检测到了特异性sI矾，而且VP4一LTB共表 达菌株在诱导slgA抗体水平和持续时间都明显优于单独表达VP4的重组菌。但共表达菌株 和单独重组菌的血清样本检测结果表明，虽然二者均能诱导产生较高IgG抗体，但抗体水平 无明显差别。通过脾细胞增殖实验及IL一4、IFN—r的测定结果表明，所构建的重组干酪乳 杆菌表达系统可诱导明显的细胞免疫应答。 采片j病毒中和实验检测针对猪轮状病毒免疫保护性抗原VP4产生抗体的病毒中和能力。 好的免疫效果，实验结果充分说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在 东北农业人学农：‘#倾f’≠{寸沦爻 的麻川价值，为猪轮状病毒疫曲的研制提供了依据。 关键词猪轮状病毒：VP4蟹白：干酪乳杆菌：分泌表达；口服疫苗；免疫效力 Abstract 1一 ●- 一 ● … ～ -～ ● Recom