重组马耳他布鲁omp31蛋白用于间接elisa诊断抗原的研究.pdfVIP

摘 要 本研究是对马耳他布鲁菌 omp31 基因进行原核表达，并建立了以重组 OMP31 蛋 白，作为间接ELISA 方法的检测抗原，检测阳性血清中因感染牛种布鲁菌而致病的 血清。主要研究结果如下： 1.布鲁菌 omp31 的原核表达与抗原性检测 采用聚合酶链反应技术 (PCR)从内蒙古分离的马耳他布鲁菌扩增得到布鲁菌 omp31 基因片段并插入 PMD18-T 载体克隆测序,将目的基因插入原核表达载体 pET-30a 中，转入大肠杆菌 BL21 （DE3）中进行表达,用 SDS和 western-blot 检测该蛋白。结果成功构建了重组质粒pET-30a-omp31 并在大肠杆菌中，成功表达 了omp31 基因,重组蛋白能与马耳他布鲁菌阳性血清发生特异性反应。 2.间接ELISA 法检测牛种布鲁菌病的建立及应用 以重组 OMP31 蛋白作为包被抗原，筛选确定了间接 ELISA 检测方法的最佳反应 条件。重组 OMP31 蛋白最佳抗原包被浓度为 2.5µg/ml (稀释 800 倍);血清的稀释度 为 100 倍;封闭液为 1%BSA，于 37℃封闭 2h;酶标二抗反应条件为 1:5000 倍稀释; OMP31 蛋白包被孔的阴、阳性临界值为 0.337。特异性结果显示，OMP31 蛋白包被孔 与免疫 S19 疫苗的牛、羊阳性血清和标准牛、羊阴性血清不发生交叉反应。ELISA 的重复性实验重组OMP31 蛋白包被孔的批内与批间检测结果的变异系数均低于 10%。 以上结果显示，该间接ELISA 方法有很好的重复性，特异性，敏感性，因此可以作 为血清学方法来诊断有牛种布鲁菌感染的布鲁菌病。 关键词：布鲁菌；omp31；原核表达；ELISA Recombinant omp31 Proteins of Brucell Melitensis Strain Used as the Diagnostic Antigen in Indirect ELISA Test Abstract In this study, recombinant omp31 protein of Brucell melitensis strain was expressed for developing indirect ELISA for Brucell abortus strain differential diagnosis.The main results were as follows: 1.Expression and immunogenicity of the recombinant omp31 protein Brucell melitensis strain The omp31 gene were got from Brucella melitensis isolated in innermongolia by Polymerase chain reaction (PCR) and cloned into PMD-T. After sequencing, the omp31 gene were cloned into vector pet-30a and expressed in Ecoli, then detected by SDS and western-blot . The recombinant plasmid pet-30a-omp31 was constructed successfully and expressed successfully in Ecoli. The recombinant protein could react with Brucella melitensis positive serum. 2 The Establishment of Indirect ELISA for detecting brucellosis infected by Brucell abortus strain The indirect ELISA was developped