脂肽羧甲基壳聚纳米稳定体系的构建及对金葡菌生物被膜及其产毒的控制.pdfVIP

脂肽羧甲基壳聚糖纳米稳定体系的构建及对金葡菌生物 被膜及其产毒的控制 摘要 羧甲基壳聚糖(CMCS)是一种水溶性好，具有广谱抑菌活性的阳离子多糖，目前 在医药、食品保鲜等领域具有广阔的应用前景。将其制备成纳米级粒子可以增强其抗 菌性能。由于壳聚糖纳米粒制备过程中常出现纳米化粒子重新团聚等问题，影响了使 用效果。因此，改进壳聚糖纳米粒的制备方法，构建纳米化粒子稳定体系，成为研究 者关注的热点问题。而纳豆菌抗菌脂肽(Bacillus natto antimicrobial peptide, BNAP)是 一类天然抗菌脂肽，是一种安全无毒的、具有油水两相的良好的生物表面活性剂，不 仅有很好的抗菌活性，且乳化性能优良，可作为壳聚糖纳米粒稳定剂的良好选材。近 年来，生物被膜给食品工业带来的严重食品安全问题已引起人们的广泛关注，寻找高 效的控制方法成为科学工作者关注的热点。由于生物被膜致密的结构，许多抗菌制剂 难以迅速渗透进入被膜内部杀死菌体。而羧甲基壳聚糖制成纳米粒后，其粘度降低， 粒径大大减小，将更容易发挥对生物被膜的控制作用。因此，考察新工艺制备的纳米 粒对生物被膜的控制作用，对于研究和建立生物被膜控制新方法具有重要意义。 本文通过抗菌脂肽乳化分散离子交联法制备羧甲基壳聚糖纳米粒，用可见光分光 光度法测定其溶解性、稳定性，乌氏粘度计测定其粘度变化，扫描电镜考察其形态变 化，测其乳化力考察其乳化性能，利用红外光谱对其结构进行表征。结果显示，通过 抗菌脂肽乳化分散离子交联法制备的羧甲基壳聚糖纳米粒，具有很好的溶解性，静置 5d 内也具有很好的稳定性，加入 BNAP 制备的纳米粒形态均一，分散性好，粘度降 低，乳化性能增强，由红外图谱可知，制成纳米粒子后羧甲基壳聚糖的结构发生了变 化。 加入 BNAP 制备出的羧甲基壳聚糖纳米粒的抑菌和杀菌效果较加之前均有很大 改善，且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制作用，但抑菌效果存在明显差异。 通过液体稀释法测定纳米粒的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC) ，牛津杯双 层营养琼脂法测定纳米粒的抑菌活性，比较 BNAP-CMCS 纳米粒、CMCS 纳米粒及 二者混合液的抑菌效果，测定了纳米粒浓度、体系 pH 值对 BNAP-CMCS 纳米粒抑菌 活性的影响。结果显示，BNAP-CMCS 纳米粒的 MIC 值和 MBC 值最小，对金黄色 葡萄球菌的抑菌圈直径（27.65±0.64 mm ）比二者混合液的抑菌圈直径（25.68±0.48 mm ）大，对大肠杆菌的抑菌圈直径（34.26±0.44 mm ）亦较二者混合液（26.28±0.38 mm ） 大，表明制备成纳米粒后，其抑菌性能有显著改善。BNAP-CMCS 纳米粒的抑菌活性 I 随浓度的增加而增强，随着体系pH 的增加抑菌能力减弱，比较其对金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌的抑菌作用，发现对大肠杆菌的抑菌作用 （34.26±0.44 mm ）较金黄色葡 萄球菌 （27.65±0.64 mm ）强。 建立金黄色葡萄球菌生物被膜模型，研究它们在不锈钢片上的形成及被膜菌的生 长情况，结合游离态金黄色葡萄球菌评价 BNAP-CMCS 纳米粒对生物被膜的形成及 被膜菌生长的作用。采用结晶紫染色染法测定生物被膜的形成情况，超声波平板计数 法测定被膜态金黄色葡萄球菌的活菌数。实验发现，被膜态金黄色葡萄球菌的生长与 其生物被膜的形成密切相关，在亚抑菌浓度条件下，BNAP-CMCS 纳米粒对生物被膜 的形成及被膜菌的生长均具有很好的抑制作用，且其抑制作用随纳米粒浓度的增加逐 渐增强。在培养初期加入低浓度纳米粒在一定时期内能很好的抑制生物被膜的形成及 被膜菌的生长，但随着游离菌菌体浓度的不断增加，生物被膜不断形成。在对数期内 加入 2MIC 的纳米粒能很好的抑制生物被膜的形成及被膜菌的生长，并能清除部分未 成熟的生物被膜。4MIC 的纳米粒对生物被膜的清除作用不明显，但对被膜菌的清除 效果显著 （P ≤0.05 ），8MIC 的纳米粒对生物被膜及被膜菌的清除效果极其显著 （P ≤0.01 ）。 结合游离态金黄色葡萄球菌的产毒情况分析被膜态金黄色葡萄球菌的产毒变化 规律，评价 BNAP-CMCS 纳米粒对被膜菌产毒的影响。结果发现，被膜态金黄色葡 萄球菌的产毒变化规律与游离菌