转bt基因棉的定和纯度检测技术研究.pdf

摘要 本文通过阳间试验，室内生测，生化分析和免疫检测试验，探讨了转 Bt基因棉的鉴定和纯度检测技术，主要结果如下： 1．利用标记基因检测转Bt棉种纯度 根据转Bt基因棉“国抗1号”转入的外源基因中含有GUS基因和NPT II基因，建立了三种转Bt基因棉种子的纯度检测方法：GUS组织化学染色 法、Km培养基法和Km叶片涂抹法，准确率都在98％以上，在检测转Bt 基因棉原始群系“20．1”时与生物测定比较准确率也在98％以上，另外，因 棉32B”转入的外源基因中不含有GUS基因，而含有NPTII基因，采用Km 培养基法和Km叶片涂抹法进行种子纯度检测时，准确率也达到98％以上。 B”， 同时，利用GUS组织化学染色法进行鉴别“国抗”系列和“保铃棉32 达到了预期效果。因此这三种方法可用于转Bt基因棉大规模制种过程中和 推广过程中良种纯度的检测，相应方法同样适用于基因组中整合有GUS基 因和NPT II基因的其它转Bt基因植物的品种。 2．应用免疫胶体金技术鉴定和检测转Bt基因棉 苏云金杆菌HD--!胞晶混合物经碱溶解和酸沉淀，得到Bt粗毒素蛋白， 将粗蛋白在碱性溶液中溶解，胰蛋白酶消化处理，经硫酸铵分级分离，葡聚 糖凝胶纯化，获得分子量为66．2KD左右的两种多肽，生物测定时对棉铃虫 有毒杀作用，证明为Bt毒蛋白，据资料为CryIA(b)和CryIA(c)。 以上述纯化的Bt毒蛋白为抗原和以Bt毒蛋白免疫兔的多克隆抗体为抗 体建立双夹抗原方法，并通过生物素和链亲和素的放大信号作用，建立了斑 点金免疫渗透滤法和初步组装了检测试剂盒，并进行了试剂盒的优化。 本次试验采用柠檬酸三钠还原法制备了15nm的胶体金溶液，发现用加 热磁力搅拌器制备的胶体金溶液颗粒均匀，且重复性较好。 采用15nm胶体会标记抗体和标记链亲和素，其蛋白最适保护量分别为 抗体做显色剂时，效果不佳，因而采用生物素标记抗体建立双夹抗原，再用 会标链亲和素为显色剂效果佳。 渗透检测试剂盒的组装需要经过膜的切割、处理、包被、封闭、洗涤、 装膜的过程，实验中对各种成份进行了优化：Amersham公司O．45urn的硝酸 纤维素膜效果较好；80％乙醇处理后，室温干燥5h，37℃恒温箱干燥3h，选 用O．005MPH8．4的硼酸盐缓冲液作为抗性缓冲液；包被抗体集中，效果较好； 抗体包被浓度62．5ug／ml，点膜lnl效果最好：封闭液用 lul；金标显色剂对检测有一定的影响，金标链亲和素效价为1：3，3ul时本底 低，显色清晰，为最佳用量；质控子点包被抗原浓度为1．25ng／ml，lul：用 0．005MPH9．0硼酸盐缓冲液效果最佳，洗涤液选用PH7．6 0．02M硼酸盐缓冲 于40ng／ml。本实验还进行了验证实验，准确率100％，值得强调的是待测转 Bt基因棉的组织匀浆必须清澈无色，否则会影响结果的判读。因此，该方法 是可行的，但由于操作和试剂携带等原因，使其大量应用受到限制。 3．单粒种子室内生测鉴定转Bt基因棉的抗虫性 根据转Bt基因棉种子中的Bt毒蛋白在萌动时很快达到较高水平．对利 用单粒种子室内生测法，鉴定转Bt基因棉抗虫性进行了初步的研究，结果 为在25℃左右(即室温下)转Bt基因棉种子萌动72h后匀浆与O．459饲料 混合，接2F1龄棉铃虫幼虫进行生测较为适宜；得出的结果与棉叶生测结果 对比，据国家“863”计划项目组制定的抗性评价标准，进行抗性等级评价： 棉铃虫幼虫校正死亡率小于25％为中抗，处于25．50％间为抗，在50．65％fhj 为高抗，大于65％为特高抗。 转Bt基因棉在生长发育过程中Bt毒蛋白的表达量呈时空变化，且易受 施肥量和气候的影响，不同条件下尘测结果不一样，存在结果的不可比性， 种子室内生测可克服这些缺点，因而容易建立统一标准。 4．转Bt基因棉原始群系“20-1”的抗性鉴定和筛选 2000—2002年采用卡那霉素叶片涂抹法和室内生物测定法筛选和鉴定转 Bt基因棉原始群系“20—1”两代，对单株进行了抗虫性鉴定和抗性级别评价， 在供试的321株材料中，筛选出特高抗棉株22株高抗棉株19株，并将这些 棉株的自交铃种子种成株行，进行了纯合株行(抗性基因纯合)的筛选，筛