h9n2亚型猪感病毒ha基因的遗传演化与真核表达及其免疫原性研究.pdf

摘要 猪流感病毒血清学调查结果表明，我国猪群中不仅广泛存在H1N1亚型、H3N2亚型 流感病毒，同时HgN2亚型近年来也广泛存在猪群中，为了有效的控制猪流感的发生， 研制有效的疫苗进行预防是控制流感发生和切断禽一猪一人传播途径的有效方法，目前用 于猪流感的疫苗主要是灭活疫苗，相对于禽流感疫苗由传统的全病毒灭活疫苗、亚单位 疫苗、重组病毒灭活疫苗、重组活载体弱毒疫苗、基因疫苗的发展而言，猪流感的疫苗 研发相对落后。 病毒姒基因序列测定与分析，研究我国现存流行的H9N2亚型猪流感病毒变异状况，然 后挑选同源性较高的一株病毒(14株病毒中HA基因同源性最高的)，将其HA基因克隆到 PCAGG真核表达载体上，构建基因疫苗，进行体外表达试验，然后将基因疫苗免疫BALB／c 小鼠，检测小鼠抗体生成情况及攻毒后保护情况。 首先将分离到的14株病毒进行纯化，增殖后提取病毒RNA。在通用引物作用下370C HA基因片段 水浴进行反转录，扩增病毒的cDNA，再在以01i906．O软件设计的H9N2SIV 特异PcR引物作用下，用高保真聚合酶经PcR扩增出病毒HA基因，将HA基因克隆到 所有序列，应用MegAlign进行同源性比较和进化分析。根据比较结果，选择 鉴定、酶切鉴定，挑选HA基因正向克隆到pMDl8一T载体上的阳性质粒，然后采用sac I、sphI两种限制性内切酶，酶切处理pMDl8一T／HA阳性质粒，胶回收备用；同样用sac I、Sph I两种限制性内切酶，酶切处理PcAGG载体，胶回收备用；然后将均经过酶切 处理的载体、HA基因用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转入JMl09大肠杆菌感受 态细胞中，涂板，筛选阳性菌落。将筛选的疑似阳性进行PcR鉴定、多酶切鉴定(一般 选择三种或三种以上限制性内切酶进行酶切鉴定)，将PcR鉴定、多酶切鉴定正确的菌 液，用eppendorf转染质粒提取试剂盒提取转染质粒：之后将转染质粒与脂质体经 之后转移到硝酸纤维素(NC)膜上用H9亚型禽流感病毒特异性多克隆血清做为一抗， 碱性磷酸酶标记的羊抗鸡IgG为二抗，进行westernblot检测构建质粒所表达的HA基 因蛋白。通过westernblot检测，证明所构建质粒能很好表达f{A基因蛋白，然后大量 提取质粒，将质粒按不同剂量(10u u g、100g)，免疫BALB／C小鼠，初免三周后加强免 疫一次，采取免疫前，免疫后第三周(加强免疫前)、加强免疫后两周、攻毒后第6d的 Ⅵ ug 鼠肺脏，研磨处理后进行病毒滴定，检测疫苗保护情况。疫苗免疫结果表明，loo 剂量初免后三周加强免疫一次，可保护小鼠受同源病毒的攻击。 关键词：猪流感H9N2亚型病毒，真核表达载体，基因疫苗 vIl Abstract andH3N2sⅣhad tllesIV scentistsfoundthaInot theHlNl scmm，the TbroughinvestigaljIIg only uvedin and als0也eH9N2had丽deIy widelylivedin恤swines，but the alld tlleaviani棚uenzaVinls swine controlSⅣepideⅡ血e雎ctivelyprevent through i