结核杆菌hsp5与egfp融合基因的构建及树突状细胞疫苗的制备.pdf

中文摘要 研制开发有效的新型抗结核疫苗，是当前结核病研究的主要目标。树突状细胞 (DC)表面具有高密度的抗原递呈分子和共刺激分子，能刺激初始型(naive)T细胞大 量活化增殖。分枝杆菌Hsp65蛋白热〔休克蛋白)作为免疫优势抗原，能诱导和增强机 体的抗结核免疫应答。我们用含有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的质粒 pEGFP-C1作为载体，用结核杆菌H37Rv株Hsp65DNA为目的基因，构建重组质粒 pEGHsp65,以其转染真核细胞，观测蛋白表达。再将其导入DC中 制备新型抗结核 的DC疫苗。 本研究根据结核分枝杆菌基因序列，设计一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv 标准毒力株的总DNA为模板，经过PCR循环扩增出Hsp65目的基因，将回收的PCR 产物和载体pEGFP-Cl用限制性核酸内切酶Bgl11,EcoRI双酶切，再用T4DNA连接 酶连接，筛选得到的pEGHsp65阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序鉴定。用质脂体方 法将重组质粒转染入真核细胞(人宫颈癌细胞Hela细胞)，在共聚焦显微镜下观测荧光 表达强弱，以调整优化转染条件。分别收集pEGHsp65,pEGFP-C1质粒转染的Hela 细胞，提取总RNA进行逆转录得到cDNA，将其作为模板，