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-3 鱼油改善胃肠外营养相关性肝病及其内质网应激机制在细胞水平的研究 中文摘要 -3 鱼油改善胃肠外营养相关性肝病及其内质网应 激机制在细胞水平的研究 中文摘要 目的： 通过培养新生兔原代肝细胞，并建立肠外营养相关性肝病(Parenteral nutrition-associated liver disease ，PNALD)细胞模型——肝细胞脂肪变模型，研究内 质网应激 （Endoplasmic reticulum stress ，ERS ）相关标志蛋白——糖调节蛋白 94 （GRP94 ）在新生兔肝细胞的表达变化，探讨GRP94 在PNALD 发病机制中的作用， 并试图在细胞水平揭示鱼油改善PNALD 可能的作用机制，为临床预防和治疗PNALD 提供新的思路和实验依据。 材料与方法: 母乳喂养 7 日的新西兰新生兔8 只，雌雄不限，饲养于恒温暖箱，温度维持在 26～28 ℃之间，相对湿度40%～60%，全麻下剖腹取肝脏组织，采取I 型胶原酶消化 法获取肝细胞，并行传代、培养。将原代肝细胞随机分五组（组1、组2 、组3、组4 、 组5 ），分别以DMEM 培养液，0.2%、0.4%、1%、2 % 的脂肪乳培养肝细胞。在不 同的时间点(24h、48h 、72h、96h)分别对各组细胞进行油红O 染色观察细胞脂肪变情 况，同时行MTT 法检测细胞活性，以确定建PNALD 细胞模型的脂肪乳最适浓度。 另将原代肝细胞随机分成对照组（CON 组）、1%鱼油组（A 组）、0.4%鱼油组 （B 组）、1%脂肪乳组（C 组）和0.4%脂肪乳组（D 组）五组，CON 组用DMEM 培养液培养，A 组用1% -3 鱼油脂肪乳培养，B 组用0.4% -3 鱼油脂肪乳培养，C 组用1%脂肪乳培养，D 组用0.4%脂肪乳培养。在不同的时间点(24h、48h、72h，96h) 分别收集五组细胞通过油红O 染色及电镜观察肝细胞脂肪变情况；MTT 法检测细胞 活性；全自动生化仪检测各时间点（0h、24h、48h、72h ）细胞培养液生化指标变化； 采用半定量逆转录多聚酶链式反应法（RT-PCR ）检测肝细胞 ERS 相关标识蛋白— GRP94mRNA 的表达；采用免疫组织化学技术检测肝细胞GRP94 蛋白表达。 I 中文摘要 -3 鱼油改善胃肠外营养相关性肝病及其内质网应激机制在细胞水平的研究 结果： 5 1.原代肝细胞培养：实验共获得肝细胞 8.82 ×10 个，台盼蓝染色细胞活率为 92.11% 。培养4 h 后细胞开始贴壁，24 h 后可见90% 以上肝细胞已贴壁，8~10d 细 胞连接成单层。PAS 染色后，低倍镜下可见肝细胞有大量红染的糖原颗粒，高倍镜可 见下细胞质内密集粉红色糖原颗粒。 2.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定：五组肝细胞4 个时间点（24h 、48h、72h、 96h ）五组肝细胞MTT OD 值比较均有统计学意义（P ﹤0.01 ）。与组1 相比，组 5 在4 个时间点 OD 值均明显降低，差异有统计学意义（P ﹤0.01 ）；组4 仅在96h 细 胞OD 值较组1 下降明显（P ﹤0.0 1），其余3 个时间点无明显改变 （均P ﹥0.05 ）； 组2 和组3 在4 个时间点细胞OD 值均无明显下降（P ﹥0.05 ）。 3.造模后各组肝细胞形态、活力、超微结构变化：五组肝细胞在培养 24h 、48h 和72h 三个时间点MTT OD 值无明显改变，差异无统计学意义（P ﹥0.05 ），96h 细 胞OD 值在五组之间比较，差异有统计学意义（P ﹤0.01 ），且C 组较CON、A 组、 B 组和D 组均明显下降（P ﹤0.01 ）；