人巨细胞病毒mr-ul70-1-5p靶基因的筛选与鉴定.pdf

·中文论著摘要· i 人巨细胞病毒mR-UL70-1-5p靶基因的 筛选与鉴定 目的 人巨细胞病毒(human 是引起新生儿疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病机 能的研究少有文献报道，而且最近有学者对其表达与否存在质疑。本研究拟采用 PCR，荧光素酶报告基因表达检测实验和免疫印迹实 实时荧光定量PCR，hybrid 验(western 控作用。 材料和方法 一、实验材料 标本为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保存的临床低传代分离株Han 株；所用试剂为涉及反转录、RNA提取、PCR扩增、基因重组、荧光素酶报告基 因检测、免疫印迹等实验的相关试剂盒；常用实验设备包括Beckman台式低温高 速离心机、Bio．radPCR循环仪、细胞培养箱和荧光检测设备等：常用数据库及分 析软件包括基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。 二、实验方法 l、采用实时荧光定量PCR的方法检测HCMV感染人胚肺成纤维细胞中 miR．UL70．1．5p的表达，并回收扩增产物进行克隆测序。 PCR的方法筛选靶基因。 2、通过hybdd 表达载体pMIR中，通过荧光素酶报告基因表达检测荧光值的变化，确定 miR-UL70．1．5p与靶基因的结合作用。 4、通过weStem 么}里 ；日7K 达量随病毒培养时间的延长而增加，感染后72小时最高。 PCR筛选，共得到10个候选靶基因，涉及到生物大分子合成、 2、经过hybrid 细胞间连接、细胞凋亡、能量代谢、病毒复制等方面。候选靶基因有8个来源于 宿主，2个来源于病毒基因组。 3、荧光素酶报告基因表达检测结果显示7个候选靶基因明显受到 即刻早期反应蛋白3(IER3)：酪氨酸3．单加氧酶／色氨 邻域蛋白(COX4NB)； l(CTNNAl) 酸5-力口单氧酶激活蛋白，B．多肽(YW}L惦)；钙粘蛋白相关蛋白；a UL70。 和HCMV 4、对靶基因IER3进行了蛋白表达水平的检测，结果表明在表达IER3的重 调超过30％。 结论 blot 或病毒的靶基因在荧光素酶报告基因表达检测中受到负调控；并且用westem 证实了miR．UL70．1．5p对IER3蛋白的表达具有明显下调作用。 关键词 人巨细胞病毒：miR．UL70．1．5p；即刻早期反应蛋白3(IER3)． 2 ·英文论著摘要· mRNAsof Screenandidentificationof human target miR-UL70--1--5p cytomagelovirus ective obj Human is inthe cytomegalovirus(HCMV)infectionwidespreadpopula