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4.3 亲和色谱(层析) Affinity Chromatography, AC 第一节 概述 原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性 二、应用 高效从复杂混合物中得某一种物质； 基于生物功能可把有活性与无活性分开 三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图） 说明： 1.偶联用Gel（须是活化偶联介质） 2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂 3.按相互作用力划分： 次级键——亲和色谱 配位键——螯合色谱 共价键——共价色谱 疏水键——疏水色谱 亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件 第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活 ㈡常用系统 酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞 ㈢ 配体的浓度 一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合) ㈣ 配体的选择 1.?考虑亲和势 L + S LS Kl= [L][S]/[LS] 要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2.??与L的偶联不破坏L与S的结合 3.??需了解L-S的作用机制 如…… 例：酶 有单底物反应、双底物反应 单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以 双底物依次 A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A 双底物随机 A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。 第三节 亲和层析载体 一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好 二、载体的选择 1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。 ?????????? 三、手臂（Spacer arm） 在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。 示意图如下： 连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）； 疏水性手臂具体选择应考虑： ⑴ 分离物质分子量大小 ⑵ 亲和势大小 ⑶ 过长手臂易弯曲、折叠等； 最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。 第四节???亲和吸附剂的制备 一、要求 ㈠.??? L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡.??? L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合更有效； ㈢.??? 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。 二、???? 偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠.??? L上可供