nf-y和sp在顺铂上调卵巢癌细胞topoⅱ表达中的作用.pdf

中文摘要 NF-Y和Spl在顺铂上调卵巢癌细胞 topoH表达中的作用 摘 要 目的：卵巢癌因为缺乏有效的早期诊断方法，被发现时 往往多为晚期，其死亡率居妇科肿瘤首位。目前，对卵巢癌 患者化疗仍是最重要的辅助手段，尤其在晚期卵巢癌治疗中 具有极为重要的意义。加之卵巢癌细胞在化疗过程中容易产 生耐药，因此寻找更为有效的化疗方案是提高卵巢癌疗效的 重要途径。目前多选用顺铂为一线化疗药物，同时由二线化 常用，二者可通过不同的作用机制抑制肿瘤细胞的繁殖【¨。 许多研究表明，癌细胞对DNAtopolI抑制剂的敏感性依赖于 topolI抑制剂的敏感性就减低，且容易产生耐药。在对细胞 减少、启动子活性降低，转录因子NF-Y和Spl水平下降。 和Spl具有协同作用12】。阴梅云教授在此前的研究首次发现， 猜想这可能与topolI启动子区转录因子的调节有关。本实验 选用顺铂和足叶乙甙合用，通过体外作用于卵巢癌细胞系 SKOV3，采用免疫印迹方法观察用药前后肿瘤细胞内转录因 中文摘要 游调控因素的影响。全面探讨药物作用机理，从而减少耐药 性产生，为临床合理配伍用药提供理论依据。 方法： ’ 1细胞培养卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3为本实验室所 冻存。以内含10％胎牛血清、100IU·mE-1青霉素、100 mol·L-1 mmol·L．1谷氨酰胺及1HEPES的 弘g-mL-1链霉素、4 2药物浓度选择、试验分组 u 参考药物的血浆峰浓度(PSC)，其中CDDP为3 la g／r,a；vv．16为5 g／rm，进行试验分组。实验组：(王)CDDP 分别与CDDP的上述三种浓度合用。同时设空白对照组。 3核蛋白的抽提及Westernblot分析 3．1核蛋白的抽提及含量测定 取对数生长期细胞，经0．25％胰蛋白酶消化后，加入培 养液吹打均匀，以lxl05细胞浓度接种于高压过的无菌培养 瓶中，24h后加入药物与细胞共培养。取培养细胞5x106刁个 ／ml弃去培养液，细胞用预冷的PBS洗涤两遍；加入lml预 mL 冷的PBS，用细胞刮刀将细胞刮下，将此混合液移入1 Eppendorf管中，4℃，30009离心10min，弃上清。通过两 次核裂解法裂解细胞，具体操作步骤参照(核蛋白抽提试剂 盒操作步骤)。将最后所得上清转入一预冷的洁净微量离心 管，即得核蛋白。用考马斯亮蓝G．250法测定蛋白浓度，分 装，．70℃保存，避免反复冻融。 中文摘要 Western 3．2 blot分析 3．2．1上样：各种目的蛋白的测定取其适宜上样量，对NF-Y blot分析。在4℃ 和Spl蛋白的测定，分别上样进行Western 蛋白的分子量并依据预染蛋白分子量Marker切下大小合适 的凝胶，并切去凝胶左上角标记凝胶方位。 h， 3．2．2转膜：以110mA恒流状态下，4℃电转移3．0~3．5 用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上． 3．2．3封闭：转移结束时，取出硝酸纤维素膜(每次取出都要 注意分清正反面)，在封闭液中4。C过夜。封闭结束后，在 mitt，经5％脱 TS．1脱色摇床上TPBS洗膜3次，每次10 脂奶4℃封闭过夜。封闭后加入一抗，兔抗人NF-YA多克隆 抗体、兔抗人SP