第三章PCR原理资料.pptVIP

第五章 PCR 技术原理 PCR(Polymerase chain reaction） 1．概念  PCR (Polymerase chain reaction）指通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术 模板（template) 引物（primer) dNTP Taq polymerase 2、实验原理 基本原理是依据细胞内DNA复制的机理，以及体外DNA分子变性、复性，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 其主要步骤是: 将待扩增的DNA置于高温下使之解链； 人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合； DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’向 3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 二、PCR反应体系 1．缓冲液（buffer) 10x 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0 1.5mM MgCl2 50mM KCl 2．脱氧核苷三磷酸（dNTPs） dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称 dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 3 寡核苷酸引物:人工合成的与模板DNA互补的寡核苷酸链 引物浓度0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 从引物３‘端开始，５ ３’方向延伸 退火温度按４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） 　　a 简并引物 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物 如　ＡＣＴ／Ｃ　ＧＡＴ／Ａ b 嵌套引物: 靠近5‘上游Primer与双链DNA正链相同 3下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 例如： IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3 负链3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3→5然后倒过来5→3 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 引物设计的原则 (1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 (2)引物的长度：一般长为15-30bp 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （3）Primer 本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （4）注意减少Primer间互补序列,导致2个Primer形成二聚体（dimer）,一般不要超过3个互补bp 如： CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC （5） G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3‘ 末端的重复排列。 （6）引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。 （6）Primer 5’未端可修饰、突变 修饰 如：32P、生物素、荧光素，不影响其效 突变： AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 注意：绝不可以在3端进行上述改造 ∵DNA聚合酶是5→3聚合，若3端改造→不能互补→不能延伸 （7）primer 5’端增加碱基 ①内切酶识别点： （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同 EcoRI 1