第三章植物细胞培养-资料.pptVIP

在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。但是有时候会存在有性不亲和。如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。 高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒 * 选取生长旺盛的细胞。 上胚轴和子叶 培养细胞（愈伤组织） * 纤维素酶——从绿色木霉中提取。用于活力不同：P1500、P5000、 OnozukaR-10 （常用） 果胶酶（离析酶）——从根霉、黑曲霉中提取。浓度若超过2％，分离时间过长，均易产生毒害。常用(MacerozymeR-10)。 半纤维素酶－从黑曲霉中提取。常用于从愈伤组织中分离原生质体；常用Rhozyme HP-150； 蜗牛酶——分离孢粉素、胼胝质。 * 材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。 此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。 * 黄绿色荧光 伊凡蓝 伊万斯蓝 伊文斯蓝 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗 * 在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 * 即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。 * * * 对原生质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露醇，可提高原生质体的植板率。 KM-P培养基，它包括丰富的维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖及糖醇等有机成分 。 不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是必需的，并需要二者的适当搭配。 较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。例如，豌豆原生质体在高Ca (5．3 mmol／L)中培养3、6 d，分别有10％、23％的原生质体再生细胞；而在低Ca2+(1 mmol／L)条件 下，分别只有3％、7％的原生质体再生成细胞。 * 原生质体在初期应在黑暗中培养；当形成愈伤组织时，需要强光照(2000~10000 lx)，以后甚至要强光照射才能满足生长的需要。 如柑桔类、猕猴桃等的原生质体培养较容易；葡萄原生质体的分离和培养从1974年就开始了，但到1990年才从欧洲葡萄悬浮细胞来源的原生质体 再生出植株；桃的原生质体培养至今仍只能得到愈伤组织。 荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，细胞壁呈现明显荧光。细胞壁纤维素的β-1.4-葡聚糖链相结合 一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。 一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。 * 漂浮法 原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。 离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。 界面法 500mmol/L蔗糖 140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。 100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇 +原生质体 原生质体一步酶解和沉淀纯化游离流程 离心 去掉表皮 原生质体沉降于底部 过滤 吸去上层液 酶解 粗原生质体液 加入清洗液 离心 吸去上层液 加入培养基 离心 吸去上层液 加入培养基 取少量记数 纯化原生质体液 原生质体的活力鉴定 形态识别 形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。 FDA (fluorescein diacetate， 二乙酸荧光素)： 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。 使用浓度：0.01% 荧光显微镜识别(FDA法) 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法 原生质体的培养