第三章酶的分离纯化-华工资料.ppt

1、发酵液相对纯化 （1）无机离子的去除 Ca2+ 草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 B 物理破碎法 1、温度差 2、压力差：高压冲击法 降压法 渗透压变化法 3、超声波 4、其它：冻融法、干燥法 冻融法 生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁涨破。 需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂。 干燥法 经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。 D 酶促破碎法 1、自溶法 2、外加酶制剂法 在众多的细胞破碎方法中高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。 但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏。 非机械法一般仅适用于小规模应用。 超声波处理容易使料液温度升高。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。 渗透压冲击和冻结-融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。 干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y(%)=[(N0-N)/N0]×100 N0－原始细胞数量N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量 目前N0和N主要通过下面的方法获得 ： 直接计数法在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量。 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 2、酶提取过程的注意事项 (1)盐的选择：大多数酶在低浓度的盐溶液中有较、大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。 (2) 温度的选择：一般控制在0-10 0C，如果酶比较稳定可以例外。 (3) pH的选择 ：首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择pH4-6为宜。 (4) 抽提液用量：常采用原料体积的1-5倍。 1、盐析(Salting Out)沉淀法（改变离子强度） 5 选择性沉淀法 3）等密度梯度离心 当预分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。 （3）离心条件的选择 1）离心力 2）离心时间 3）温度和pH （1）非膜过滤 粗滤：常压过滤 加压过滤 减压过滤 微滤： （2）膜分离技术 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。 膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。 加压膜分离：微滤 超滤 反渗透 电场膜分离：电渗析 离子交换膜电渗析 扩散膜分离：透析 （四）层析分离 利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同比例分部布在两相中—固定相和流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。 层析方法：吸附层析、分配层析、