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第三节 动物细胞工程 1 动物细胞特点 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化 动物细胞间的连接方式 紧密连接 间隙连接 隔壁连接 中间连接 桥粒连接 2 动物细胞培养定义 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 是动物细胞工程的基础。 3 发展历史 1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞 4 生长特性 贴附生长型 如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞 悬浮生长型细胞 如血液白细胞，淋巴组织细胞等 5 体外培养细胞基本技术 体外培养特点 体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术 5.1 体外培养特点 营养条件苛刻 适应性差, 敏感 培养时间长，易污染 培养工具 器皿为各种类型的培养瓶、培养皿、培养室、小室等 载体：空心纤维和微珠 5.2 体外培养工具 空心纤维 微球 5.3 体外培养条件 温度，37度 pH：7.2-7.4 气体，氧，二氧化碳，氮气 营养条件 需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供 动物细胞培养基 天然培养基：主要有血清，组织提取液、鸡胚汁 合成培养基 无血清培养基 动物细胞培养必需的溶液 平衡盐水 培养基pH 细胞消化液：把组织解离成分散细胞 胰蛋白酶消化液和EDTA溶液 抗生素溶液 5.4 体外细胞生长增殖过程 原代培养期 传代培养期 衰退期 5.5 培养方法 悬滴：最早由Harrison 1907年创立 旋转管： 灌注小室 培养瓶 培养板 原代培养与传代培养技术 1）组织快培养 首先从机体获得组织快，然后放入一个培养皿中用Hanks液洗，用小剪刀剪成1 mm3的组织快，加入少许培养液，塞上瓶塞置于37度培养箱培养，成单层后做传代培养。为促进细胞帖壁，也可以瓶内壁涂一层血清。 组织消化培养过程 取材分离和组织消化 培养过程 接种、培养-常规检查 传代培养技术 当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展成片，占满器皿表面。这时需要对其分离培养，这一操作过程称为传代。 （1） 吸取培养瓶内旧培养液。 （2）加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 （3）2-5 min后检查，如有细胞间隙变大或细胞质回缩现象，终止消化。 （4）吸出消化液，加入Hanks液。 （5）用吸管轻打瓶壁，使细胞脱落成悬浮液 （6）重新接种 贴壁培养技术 贴壁培养的材料： 1）玻璃 2）塑料 3）金属 4）微载体 基本操作 1）将培养材料用物理或生物化学法分散成细胞悬浮液。 2）过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。 3）放入CO2培养箱培养。 生长过程及优点 游离期 吸附期 繁殖期 退化期 优点： 1）贴壁培养比较容易更换培养基 2）容易采用灌注培养，提高细胞密度。 3）更有效表达同一产品。 4）方便地调节培养液和细胞比例。 5）易于观察细胞生长状况。 5.6 大规模培养技术 悬液培养，使用微球载体 微载体培养 多孔载体培养 微囊化培养 中空纤维法 动物细胞生物反应器培养 动物细胞培养用生物反应器种类： 微载体式 中空纤维式：最经典，最常用 灌注培养式 旋转壁式 Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某 种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限 增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。 组织工程 应用细胞生物学和工程学的原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖，扩增，然后移植到人体内所需的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的。 DMEM培养基 胎牛血清 其他成分 锥形瓶逐级放大培养 加碱（碳酸氢钠） 加糖（葡萄糖） 灌注培养液 微载体 5L种子罐培养 培养液 50L 生 物 反 应 器 接种狂犬 病毒 出液口 收获病毒 6.1 单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 （1）提出问题：从动物血清中分离抗体的方法产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏 （2）设计方案：由于每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，就可以产生单克隆抗体。由于B淋巴细胞