第二章-PCR技术资料.pptVIP

第一节 PCR技术基础 一、PCR常见问题 无扩增产物 无扩增产物 巢式PCR（Nest-PCR） 1.巢式PCR（Nest-PCR） 2. 递减PCR（TouchDown PCR） 3. 热启动PCR （HotStart PCR） 4. 使用PCR增强剂 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I GTCC GGAC CCTG CAGG GTCC GGAC CCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 质粒DNA 目的基因 限制性核酸内切酶 2.基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP 3.基因配型 4.基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测 父’ 父 子 母 现 嫌1 嫌2 嫌3 第三节 PCR常见问题、原因分析 及其解决方案 非特异性扩增 拖尾 假阳性 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 二、提高PCR反应特异性的策略 P1 P2 P3 P4 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。 （2） PCR 实验的不同需求 长片段扩增 PCR试剂盒 扩增效率 保 真 性 特 异 性 基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、 基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） 构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测 特异性 － 热启动 Taq酶 原 理 蜡封 抗体抑制