Let__7a抑制MKP1参及神经细胞缺血再灌注损伤的机制的研究.docVIP

缺血性脑卒中是临床上的常见病和多发病，其发病率及死亡率逐年升高，且表现出年轻化趋势。治疗上应尽快恢复缺血区的血液供应，提供氧气和营养物质，清除代谢产物[1-2]。然而研究发现血流再通后可能加重组织损伤，即缺血再灌注损伤（IRI）[3]，目前具体机制尚未完全阐明。已有的实验表明IRI与氧自由基的产生、钙超载所致线粒体破坏、炎症反应及细胞凋亡等相关，其中炎症反应和细胞凋亡在 IRI中起重要作用，是导致IRI神经细胞损伤的关键环节[4]。因此，抑制炎症反应，减轻细胞凋亡是目前改善缺血性脑卒中预后的关键因素。 过去MicroRNAs（miRNAs）是研究肿瘤发病机制的热点，而随着其在缺血性脑卒中研究的逐步深入，它的发现也为IRI的研究提供新的方向[5-7]。miRNAs是广泛存在于真核生物中的小分子非编码单链RNA，长度约为17-25个核苷酸，可特异性识别并与靶mRNA 的3’-非编码区配对，对基因转录后的表达进行调控，参与细胞的增殖、分化以及凋亡等生理病理过程[8]。过去的研究证实Let-7a是肿瘤抑制因子，但在脑IRI的表达和机制研究目前甚少。最近有研究发现let-7a在脑缺血损伤中的表达升高，加重神经细胞损伤[9]。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP1）主要分布于细胞核内，作为丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶（MKPs）家族成员，主要在丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的去磷酸化中起重要作用，参与细胞生长、分裂、分化及凋亡[10]。研究发现，MKP1是应激蛋白，通过调节c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38，抑制细胞凋亡，具有减轻神经细胞损伤的保护作用[11]。 本课题组通过构建小鼠脑IRI模型，观察let-7a、MKP1的表达水平；随后在动物模型上抑制let-7a表达，检测MKP1的表达，进行神经功能评价，观察细胞凋亡情况。同时检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。在PC12细胞过表达或抑制let-7a后，检测MKP1的表达变化，观察细胞凋亡情况。本研究通过体内外实验，探讨let-7a及MKP1在IRI发生发展中的相互作用，为临床寻找缓解IRI新靶点提供依据。 1 材料和方法 1.1 实验材料 雄性Balb/C小鼠60只，重量(22±3)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。兔抗小鼠MKP1抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；Tunel染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RT-PCR使用试剂（RNA提取试剂、逆转录试剂盒及SYBR试剂盒）均购自大连宝生物有限公司；MKP1、IL-6、TNF-α及GAPDH的RT-PCR引物均购自上海英骏生物技术有限公司。PC12细胞购自上海基免生物科技有限公司，1640培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司，青链霉素双抗、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；lipofectamineTM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，动物用Let-7a抑制剂、Let-7a RT-PCR正反向及逆转录引物、细胞转染Let-7a类似物、抑制剂及相应阴性对照购自广州锐博生物科技有限公司。 1.2动物分组及模型构建 将Balb/C小鼠分笼饲养于(22±2)℃的实验室，明暗各12 h，能自由饮水和进食。随机将小鼠分为假手术(n=10)、模型组（n=34)和Let-7a抑制剂组(n=10)。大脑中动脉闭塞（MCAO）的局灶性脑缺血模型的构建参考文献[12]，进行缺血2h的处理后，予以再灌注12h、24h、36h及48h。Let-7a抑制组于再灌注时在鼠尾静脉注射Let-7a抑制剂（20mg/kg），每次0.1ml。模型组于鼠尾静脉注射与抑制剂同体积的生理盐水。再灌注结束后，进行神经系统评分。在腹腔注射水合氯醛（3mL/kg），取脑组织进行相应的实验。 1.3神经系统评分 采用国际上较为通用的评分法Longa对神经系统进行评分[13]，包括6级5分法:如无神经功能缺损症状记为0分；提尾向下，无法进行完全右侧前爪伸展记为1分；行走时向右转圈记为2分；若向右侧倾倒，行走困难记为3分；无法自己行走且出现意识下降记为4分；死亡则记为5分。得分1-3认为造模成功。 1.4细胞培养及转染 PC12细胞培养于1640培养基，培养液均含有10%胎牛血清、1%双抗，置于37℃、5％CO2培养箱中。细胞融合至90%，常规使用0.25%胰酶消化液1：2或1：3传代，实验取对数生长期细胞。用H2O2造成PC12细胞氧化损伤,构建细胞缺血再灌注的体外模型[14]。转染前细胞铺于六孔板达50％-70％融合度时，根据lipofectamineTM2000说明书进行Let-7a类似物及抑制剂的转染。转染后24 h提取RNA，采用RT-PC