聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段讲解.ppt

* * 实验三 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 实验目的和要求 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。本实验以含有小鼠的基因（暂定T10）的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增出约800bp的产物。 1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。 2. 相关基础知识 PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 遗传病的产前诊断； 致病病原体的检测； 癌基因的检测和诊断；　　 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 动、植物检疫； 在转基因动植物中检查植入基因的存在。 原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 2）PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括： 引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。 引物： 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。 PrimerI PrimerII Amplified target fragment To 7 引物的设计： 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。 引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成。 引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于1kb以上的DN