实验目的掌握PCR原理;熟悉PCR的基本操作。分析.ppt

实验目的 1. 掌握PCR原理； 2. 熟悉PCR的基本操作。 实验五 聚合酶链式反应PCR （一）PCR简介 1. 即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）诞生于1985年，是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的一项技术。美国Cetus 公司的Kary Mullis发明了该技术（1993年诺贝尔化学奖）。 2. 操作过程的简化依赖于以下两项技术： 1）热稳定性Taq DNA聚合酶的应用； 2）自动化热循环仪的设计成功。 3.该项技术对分子生物学及其相关学科的基础研究和应用研究等产生了革命性的影响。 体内DNA复制过程的体外模拟 （二）基本原理 1．PCR的特征： 能大量扩增特定序列，引物结合位置将决定扩增的DNA序列。 2．PCR包括3个热循环过程： 1）双链DNA的高温变性（解链）； 2）引物与模板的低温退火（引物与模板结合）； 3）适宜温度下的引物延伸（互补链的合成）。 PCR扩增时，靶DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。 3. 扩增过程 热预变性 高温变性 适温延伸 低温退火 补偿延伸 4. PCR原理：第一循环 引物 模板DNA双链 模板DNA单链 前两个循环 前三个循环 目标分子 计算表明：用基因特异性引物扩增目的基因时，若假设开始模板分子数为x，经过n个循环后，目的分子个数为x(2n-2n) (三)反应体系 模板DNA； 引物对； 4种脱氧核苷三磷酸； 耐热DNA聚合酶； 适宜的缓冲液。 1．模板DNA(template)：单链DNA或双链DNA，cDNA 注意事项： 1）用DNA粗制品做样品，应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白质等； 2）要被扩增的DNA特定序列不需要事先从样品中分离纯化，因为PCR产物的序列，即反应的特异性，是由寡核苷酸引物序列所决定的。 3）PCR所需的DNA模板量较低。 2．引物：primer 1)概念：是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。引物序列决定了PCR扩增片段的长度、位置和结果。 2）引物设计上的基本原则： a: 一般为20~30 bp； b: G+C含量：应在45%~55%之间； c: 碱基分布的随机性； d: 引物自身：不能含有自身互补序列； e: 引物之间：两个引物之间不形成引物二聚体； f: 特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于10%，或少于连续8个互补碱基； g: 引物的3’端：3’端不应发生错配； 3．4种dNTPs：靶DNA序列的扩增原料。 注意事项： 1） dNTPs贮存液pH值应为7.0； 2）每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50~200μmol/L为宜。 3）4种dNTPs的浓度应相同。 4．DNA聚合酶 1）Klenow片段：又叫Klenow聚合酶或pol I大片段酶。 它能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸。 缺点：反应温度为37℃ 2）Taq DNA 聚合酶：最初是从美国黄石国家公园的一个温泉中发现的一种嗜热菌——水生栖热菌（Thermus aquatics）YT菌株中分离而得。此酶的最适作用温度为72℃。 （四）循环参数 1．变性温度和时间 原则上变性步骤应高温，短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。 2．退火温度： 退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度。通常反应条件为55℃。 3．引物延伸 1）引物延伸温度：Taq DNA聚合酶通常为72℃。 2）延伸步骤的时间：1000 bp/min。 4．循环次数： 一般为25-40个周期。 （五）PCR扩增仪 1．机械自动装置：固定温度控制部分，依据每一个保温阶段对温度的要求，将样品在三个控温部分之间模拟手工操作进行机械移动。 左到右有三个恒温水浴锅 95度 52度 72度 2．温度循环装置：整个PCR过程中，样品在样品台上保持相同的物理状态，而用一软件控制的加热/冷却系统进行调控，实现周期性温度改变及恒温过程的自动化。 （六）实验操作 1. 标准的PCR反应体系的构建 （总体积：20.0 μl ） 反应体系 标准加入量（μl） 实际加入量（μl） 10