PCR技术().ppt

A 正常人 病 人 正常 病人 ASO探针法 A C T G ASO探针 正常 病人 PCR-ASO检测基因点突变:主要是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP 3)基因配型 PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性 （序列特异性引物-PCR技术 ） 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？ （固定化PCR） cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG 5’ CC…CC 锚定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 6）PCR固相分析法 模板 生物素化引物 PCR扩增 探针 亲和固相介质 检测探针信号 可用于基因芯片的制作 7）原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Situ PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照