realtimePCR引物设计与常见问题分析.pptVIP

调整基线校正和ROX校正前的原始曲线，降低背景信号值 * 基线校正 基线校正的设置不当 模板含量过高，使得基线不能正常工作 * Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 引物设计及常见问题分析 引物设计原则 引物的长度：15-30 bp 扩增子的长度:100-250 (75-200 bp) GC 含量在40-60% 避免超过3个G或者C的重复片段，结合不牢 引物的Tm值：50-65 ℃ Tm值得计算Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)，与盐浓度有关（一般选择50mM ） 退火温度=Tm值-(3～12℃) Tm值与退火温度 引物设计原则 F：GGACCTCTGTAGCCGTTCTA R：TCATCTCACTCCAACGATCA 引物的Tm值：相差最好是在3 ℃ 以内 3’端以A结尾不好，一旦发生错配，引物不容易脱落 上下游引物不要互补， 尤其是3’端，容易形成引物二聚体 引物内部不要形成发夹结构 引物的长度：20 bp 扩增子的长度:145 bp 引物二聚体和发夹结构 合成新的引物 减少污染 引物设计软件 公司代为合成 （生工、invitrogen都可以免费合成） 自己合成 免费在线的包括Primer Premier 5.0 商业付费的软件 Beacon Designer 文献获取 最终获取的序列要去检测其特异性 （NCBI 网站的Blast功能） 使用Primer Premier 5.0 设计引物 如何Blast 输入引 物序列 输入目的 基因序列 如何Blast RT-PCR实验流程 DNAse I 消化 RT 形成单链的cDNA 1. 配置 Mix 2. 稀释模板 3. 加入反应管 4. PCR 提取 RNA，并 定量 可省略 减少误差 以Takara为例(20 μl体系) SYBR Ex Taq 10 μl 上下游引物各2 μl 4μl ROX 0.4μl 剩余 体积 5.6μl 可把模板稀释5.6倍 融解曲线杂峰-常见问题分析 解决方法 合成新的引物 减少污染 使用一次性的器具 改善退火温度 扩增效率过高或者过低-常见问题分析 扩增效率过低：影响检测， 尤其是含量低的目的基因 扩增效率过高：非特异性扩增 PCR阻害物质 RT反应液（≤1 微升） 提取DNA混入的酚类物质 蛋白质 （如组蛋白） 扩增曲线的信号值低-常见问题分析 多数是由于背景信号的值太高造成的，原因有 初始模板量太高，造成背景值偏高 扩增曲线右端下滑-常见问题分析 * 盐浓度 越高 Tm值越高 ，计算时 选择 50mM盐来计算 评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度， 当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。 * 选择合适的退火温度，根据Tm值上下确定 使用温度梯度的PCR仪，貌似我们所没有 * 以A结尾 Tm值得计算 ?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G值相对较高的引 物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 * 通过融解曲线分析结合凝胶电泳判断哪个是主峰，有可能是杂质或者引物二聚体 建议重新合成引物 * Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 Simmky6 * 盐浓度 越高 Tm值越高 ，计算时 选择 50mM盐来计算 评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度， 当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。 * 选择合适的退火温度，根据Tm值上下确定 使用温度梯度的PCR仪，貌似我们所没有 * 以A结尾 Tm值得计算 ?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G值相对较高的引 物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构