高效液相色谱法知识讲解资料.pptVIP

高效液相色谱知识讲解 内容概要 HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，其以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。 高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验，并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。 高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80% 则需用高效液相色谱来分析。HPLC因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析，世界各国己将该法收载于药典。 由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。 1100/1200 HPLC仪器的结构组成： 在线脱气机(G1322A,G1379A/B) 二元/四元泵(G1310A,G1311A,G1312A/B) 自动进样器(G1313A,G1329A/B,G1367A/B/C/D) 柱温箱(G1316A/B) 二极管阵列检测器(G1315A/B/C/D) 数据处理系统 流动相就比如人体的血液，其质量直接影响到整个系统的正常运行与否。 ?应该使用HPLC级的溶剂，不能互相混溶的溶剂不可以直接切换！一般在水相和与其不混溶的溶剂切换时，使用异丙醇作为过渡溶剂。 ?注意溶剂的截止波长。截止波长是指该溶剂可以在紫外检测器中使用的 最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响极限的稳定性、干扰对所分析物质的检测。 ? HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45μm滤膜过滤过的。建议每天更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防止长霉。 ?仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。 ?仪器长期不用时，不建议使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋 势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。 ?当有流路堵塞时，可以尝试将之反接后冲洗。污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵和系统的的性能。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7) 中尤其如此。 ?检查溶剂过滤器 查看过滤器是否变色(尤其是盛放水相的溶剂瓶)–拧开脱气机出口或比例阀入口管线，此时溶剂会因为重力流出。当脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出–临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常。 ?清洁溶剂过滤器 将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下，用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器放在装有浓硝酸(35％左右)的烧杯里浸一小时。用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器至水为中性可以把过滤器放在塑料烧杯内超声清洗。但是不可使用玻璃器皿将过滤器重新装好。 ?建议：定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（可以高温灭菌），每三个月至少清洗一次 ?将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面或较高处。当在四元泵上使用盐溶液或有机溶剂时，建议将盐溶液接 在下面的梯度阀口上，将有机溶剂接在上面的梯度阀口上，有机溶剂通道最好在水或盐溶液通道的正上面。建议用水定期冲洗所有MCGV通道除去可能在阀口析出的盐结晶。 ?操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30mL，对微脱气机10mL）冲洗真空脱气机,特别是当泵关闭了一段时间后(例如，过夜)，以及在通道中使用挥发性混合溶剂时，防止溶剂瓶内的玻璃滤头(过滤器)堵塞及长菌，当滤头表面有黑