分子生物学技术分子克隆.ppt

具体操作过程中遇见过的问题： 目的基因中包含想用的酶切位点——不完全酶切 载体上没有合适的酶切位点——加上个位点？ 多个目的基因需要往同一个载体上连接——挨个查序列找酶切位点？ 更简单、快捷、高效的方法？ SLIC：sequence and ligation–independent cloning SLIC：是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法. T4 DNA Polymerase： 在dNTP和引物链存在的情况下，具有模板依赖的5’-3’DNA聚合酶活性； 在无dNTP存在的情况下，具有3’-5’核酸外切酶活性 SLIC法构建重组质粒流程 SLIC法构建重组质粒效率 30 bp长度的互补序列重组效率最高；RecA可以提高重组效率 RecA的作用随着DNA浓度加大减弱 SLIC法构建多片段重组质粒 3片段连接 5片段连接 10片段连接 SLIC法构建重组质粒具体操作 SLIC法构建重组质粒具体操作 引物设计 PCR获得PTP1B序列（带有一段与载体序列） T4 DNA Polymerase处理 混合 实验目的： 构建N末端携带His tag的PTP1B的表达载体。 实验材料： pET-15b-EGFP (表达载体，N端携带His tag, 洪梅构建，已测序) pGEX-6p-2-PTP1B (full length) （PTP1B N端携带GST tag） PCR反应体系 (TransStart FastPfu DNA Polymerase, Easy Taq DNA Polymerase) 限制性内切酶（XhoI、NdeI） 实验方法（简易）： 以pGEX-6p-2-PTP1B(full length) 为模板，设计引物扩增得到PTP1B片段。 双酶切处理pET-15b-EGFP载体，得到pET-15b载体。 将PTP1B片段插入pET-15b载体，构建得到N末端携带His tag的PTP1B表达载体。 详细实验方法见下文。 质粒提取: 使用TIANGEN质粒小提试剂盒，提取方法见说明说。提取获得pET-15b-EGFP质粒，体积约为40 ml ，浓度未测。 质粒酶切处理 : 37oC孵育6 h（此时如需暂停，可80oC加热5min使限制性内切酶失活，并置于-20oC保存）。 琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图1）。 配置1%的琼脂糖凝胶(使用大孔梳子，用于胶回收)，上样并电泳(使用新配的TAE缓冲液，电压使用80~90 V)，结果如图3。 使用Omega Gel Extraction Kit回收目的片段，方法见说明书。 回收后的片段电泳检测（图4），随后置于-20oC保存。 pET-15b-EGFP 双酶切(ml) 单酶切(ml) ddH2O 4 6.5 10x FD buffer (green) 5 1 NdeI 1.5 0 XhoI 1.5 0.5 Vector 38 2 Total 50 10 质粒双酶切处理用于后续SLIC，同时取出少部分质粒单酶切处理做对照，反应体系如下： M 1 2 M, Marker 1, pET-15b-EGFP/XhoI 2, pET-15b-EGFP/NdeI+XhoI 图1 pET-15b-EGFP酶切验证结果 接种: 一、待插入载体（pET-15b）的准备 接种50 ml pET-15b-EGFP甘油菌至40 ml LB (50 mg/ml 氨苄青霉素)， 37oC, 200 rpm过夜培养。 二、目的片段准备 PCR扩增目的片段: PTP1B 1-450 (ml) 120-450 (ml) ddH2O 31.5 31.5 5x TransStart FastPfu buffer 10 10 2.5 mM dNTPs 5 5 oPX386 1 0 oPX387 1 1 oPX388 0 1 Template (PTP1B full length) 0.5 0.5 TransStart FastPfu DNA polymerase 1 1 PCR反应体系如下： 引物设计: 根据SLIC原理，引物前15 bp与载体互补(橙色标记)，设计引物如下： oPX-386 (PTP1B 1-450 Forward primer for SLIC): CGCGGCAGCCATATGGCTTTGGTCACGGTCCAGC oPX-387 (PTP1B 1-450 Reverse primer for SLIC): AGCCGGATCCTCGAGTCATTTGCTTGCCAGCAAGAT oPX-388 (PTP1B 120-450 Forward primer for SLIC): CGCGGCAGCCATATGGAAAGCATCGTCCTAGGAATG PC