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第6章 分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术 教学目的： 1. 熟悉基因表达研究技术的原理和流程。 2. 熟悉基因敲除的原理和类型。 3. 熟悉基因芯片技术的原理和工作流程。 4. 了解利用酵母来鉴定靶基因的功能。 教学重点： 各种技术的基本原理和流程。 第6章 分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术 6.1 基因表达研究技术 转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度，是目前基因表达研究的基本思路。 转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录组测序技术。 1)表达序列标签测序(EST) 原理： EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5?端和3?端单向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为360±120bp。 EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。 操作流程： 组织样品mRNA的提取→逆转录合成cDNA→构建cDNA文库→测序。 2)基因表达系列分析(SAGE) 原理: SAGE是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。 通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。 操作流程： 以寡聚dT为引物反转录合成cDNA，用锚定酶酶切。 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. 用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。 用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。 对标签数据进行处理。 3)转录组高通量测序(RNA-Seq) 原理： 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。 对cDNA进行高通量测序，以获得来不同mRNA片段在特定样本中的含量。 各种类型的转录本都可以进行高通量检测。 操作流程： 样品RNA准备 cDNA文库构建 DNA成簇扩增 高通量测序 数据分析 6.1.2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。 6.1.3 原位杂交技术 原位杂交技术(ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。 RNA原位杂交 组织切片中，对特定基因的表达产物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析。 染色体原位杂交也称为荧光原位杂交(FISH) 可确定特定的DNA序列在染色体上的位置。 原理： 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 操作流程： 以经过标记的已知核酸分子为探针。 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。 再对其探测。 6.1.4 基因定点突变技术 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。 1)寡核苷酸定点突变 原理： 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子链。 将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突变体，其中基因已