分子生物学聚合酶链式反应.pptVIP

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） 一、PCR 的基本原理 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增 1、DNA模板变性 与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA 2、模板与引物退火 PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。 ⑴引物短，不易缠绕； ⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补； ⑶引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。 3、引物延伸 在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5→3方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。 Taq DNA Polymerase (thermus aquaticus) ①耐高温: 93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。 ②高度的扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75% 尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应 (Plateau) ，产物的量不再增加。 “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 PCR原理回顾 PCR原理.flv 二、PCR技术的特点 1、高度的敏感性 2、高度的特异性 3、操作简便、快速 4、适用样品广泛 三、PCR基本反应 1、以DNA为模板的反应：已经建立了标准的PCR反应条件 标准PCR反应体系与反应条件 2、以mRNA为模板的反应： 又称逆转录-PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）3、PCR产物的积累规律4、PCR反应的自动化 四、PCR条件的优化 必须具备下列基本条件 1、模板核酸（DNA/RNA） 2、人工合成的寡聚核苷酸引物 3、合适的缓冲体系 4、Mg2＋ 5、脱氧核苷三磷酸 6、耐热DNA聚合酶 7、温度循环参数（变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数） 模板的制备 用于PCR模板的制备方法多种多样，标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。 DNA模板的制备相对容易 在制备RNA模板时，要注意防止RNA降解。 2、引物 　　　　细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。其设计与PCR反应的成败关系密切。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。引物设计的基本要求是： （1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 （2）ATGC最好随机分布，保证引物中G＋C比例为50%±5%。 （3）避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。 （4）两引物的Tm值应＜5℃。 （5）引物与非特异扩增区序列的同源性＜70%，特别是3’端的8个碱基。 （6）3’端一定要与模板DNA配对，其末尾最佳碱基应选择G和C。 （7）5’端最多可游离十几个碱基，可以修饰（如加限制酶位点、引入突变位点、作标记、加短序列－起始或终止密码子等）。 　　　　检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。 其它注意事项：  （1）当在引物5’端添加酶切位点时要考虑： a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点 ；在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。 b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择。 （2）加入其它序列时：若想在目的序列上附加上并不存在