分子生物学讨论课DNA测序原理发展及医学应用.ppt

第三代测序技术 Heliscope单分子测序仪 SMRT技术 纳米孔单分子技术 发展 发展 应用 应用 疾病预防 疾病治疗 科学研发 产前预防：包括唐氏综合症、地中海型贫血等基因缺陷带来的重大疾病 已知靶点预防：乳腺癌、卵巢癌 用药指导：如肿瘤靶向药物的个性化治疗，用药更精确 术后检测：更早注意到基因的突变，改变用药 药物筛选：新一代药物的研发筛选 应用 DNA测序技术的原理发展及应用 DNA测序技术的原理发展及应用 生命真是个奇妙的东西，未知的事物吸引着人们奉献终生去探索 DNA测序技术的原理发展及应用 DNA测序技术的原理发展及应用 1954年，whitfeld等就提出了测定测定多聚核糖核苷酸链的降解法，该方法利用磷酸单酯酶的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化作用从链末端逐一分离寡核糖核苷酸并测定其种类。但由于操作复杂等原因，该方法没有被广泛应用 DNA测序技术的原理发展及应用 在1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法[5]。 该方法的原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。 与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 读取合成链的核苷酸序列时，应从下往上读取。因为电泳时是从上向下的，即上为负极，下为正极，DNA带负电，从负极向正极移动。其中，小片段DNA移动速度最快，距离正极的点样处最远。所以，应该从最小片段读起，即，从下向上读取。 而模板链则应该从上向下读取，并且转换为测序的核苷酸的互补的核苷酸 DNA测序技术的原理发展及应用 DNA测序技术的原理发展及应用 DNA测序技术的原理发展及应用 同一年，Gilbert等提出了化学降解法[6]。该方法与Sanger法类似，都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。 二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。 即 Maxam-Gilbert 化学降解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法，其原理为：将一个DNA片段的5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基（表6-1），从而产生一系列长度不一而5端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。 DNA测序技术的原理发展及应用 Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G ， C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。 化学降解测序法既可以标记 5#39;-末端，也可以标记 3#39;-末端。如果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的 DNA 链序列。 DNA测序技术的原理