分子生物学课件PCR.pptVIP

* * *  * * * * * * * * * * *  * * * * * * 　 * * * * * * 　　 * * * *  * ④循环次数 循环次数影响PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般为25-30次，35次左右时，达到平台期。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR扩增产物分析 1.凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB染色,紫外仪下观察.PCR产物片段的大小应与预计的一致。　　①琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。　　②聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，而且DNA回收纯度高。 2. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 3. 分子杂交：如Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。 4. 斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 5.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。 ★ 设定对照 阳性 阴性 电泳 样品 ＋ － S 阳性 阴性 样品 ＋ ＋ ＋ － － － S S S ① ② ③ 阳性对照: 是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 PCR反应的关键环节有: ①模板的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量及活性 ④PCR循环条件 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失 注意 1、PCR常见问题： 出现非特异性扩增带 无特异性扩增带 2、出现非特异性扩增带可能原因 酶量过多 Mg2+浓度过高 dNTP浓度过高 引物浓度过高，引物设计特异性差 模板纯度差 退火温度过低 循环次数过多 阳性 阴性 电泳 样品 ＋ － S 3、无特异性扩增条带可能原因 阳性对照有扩增条带，说明酶、底物、bf无问题，检查模板与引物，一般是引物的问题。 可能退火温度过高 没有加酶 片状拖带或涂抹带 　　 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 对策： ①减少酶量，或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓度。 ④减少循环次数。 假阴性 模板：①模板中含有Taq酶抑制剂. ②提取制备模板时丢失过多，或吸入酚. ③模板变性不彻底.对策：配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。（有时忘加Taq酶）. 3. 引物：引物的设计、质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 对策为： ①选定好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物降解失效。 假阴性 4.Mg2+浓度：浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量，甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 5.反应体积的改变：在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 6.物理原因：如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率.退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 7.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 现象：①空白对照出现目的扩增产物。 ②出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而可能扩增出的PCR产物为非目的性的序列。引物太短，容易出现假阳性。 靶序列或扩增产物的交叉污染：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污