分子生物常用技术未修改.pptVIP

第六章 常用分子生物学技术 1.掌握：常用分子生物学技术的基本概念与基本原理。 2.熟悉：常用分子生物学的基本方法。 3.了解：常用分子生物学技术研究进展以及在药学中的应用。 原理 分子杂交技术是利用单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其它分子的相互作用进行目的核酸、蛋白检测的技术。 二、核酸探针及标记 定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。 制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。 探针所携带的标记物应具备的条件： 标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 稳定性好、环境污染少、价廉。 常用的探针标记物： 放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。 非放射性同位素： 地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 三、分子杂交的应用 Southern 印迹法 Northern 印迹 Western 印迹法 原位杂交 生物芯片 一、Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 二、Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 利用FISH技术诊断Down综合征 图示：利用21号染色体特异性探针对一位高龄妊娠妇女进行产前诊断，未培养的羊水细胞进行荧光原位杂交, 显示所检测的细胞均 有3个杂交信号,经选择性人工流产后确诊为Down综合征患儿。 Western Blotting 五、DNA芯片技术的概念 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。 生物芯片分析过程 生物芯片技术的应用 applications of biochip technology 基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面： 一是高度的灵敏性和准确性； 二是快速简便； 三是可同时检测多种疾病。 如应用于产前遗传性疾病检查，抽取少许羊水就可以检测出胎儿是否患有遗传性疾病，同时鉴别的疾病可以达到数十种甚至数百种，这是其他方法所无法替代的，非常有助于“优生优育”这一国策的实施。。 又如对病原微生物感染诊断，目前的实验室诊断技术所需的时间比较长，检查也不全面，医生往往只能根据临床经验做出诊断，降低了诊断的准确率，如果在检查中应用基因芯片技术，医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染；而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种抗生素产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等，这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案； 生物芯片技术的应用 第二节 目的基因制备技术 一、PCR技术 PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个DNA分子。其中目的片断为2n-2n，非目的片断为2n。 OUTLINE 3 concepts 5 Essential Components 3 steps One sentence 3 Concepts of t