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分子诊断技术 常见的核酸分子诊断技术 核酸分子杂交 ( Nucleic acid molecular Hybridization) 基因芯片（ Gene Chip ） 聚合酶链反应( polymerase chain reaction reaction；PCR) 核酸分子杂交的原理 双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链成两条互补的单链核酸。 在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链核酸。 用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交，通过检测标记探针的信号，可判断标本是否存在与探针互补杂交的同源核酸。 核酸分子杂交探针的制备 制备探针的靶核酸可通过: 分离、切割病毒的特定核酸片段获得; 用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，经扩增和纯化大量获得; 选择已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为常用，过短易出现非特异性杂交。 核酸分子杂交探针的制备 常见的用于标记探针的示踪物质 放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，杂交后可通过放射自显影技术进行检测 非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等，杂交后可通过底物显色、化学发光等技术进行检测 核酸分子杂交示意图 核酸分子杂交的程序 常用的核酸分子杂交技术 斑点杂交（spot blot hybridization） 凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization) 原位杂交（in-situ hybridization） 斑点杂交  凝胶电泳印迹转移杂交 原位杂交(Southernblot hybridization) (in-situhybridization ） 核酸分子杂交技术的应用 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性 等 在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中 。 基因芯片 基因芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 基因芯片的作用原理 基因芯片的制作方式 基因芯片技术流程 基因芯片的应用 基因表达分析 　　　　　　分析基因表达时空特征 　　　　　　基因差异表达检测 　　　　　　发现新基因 　　　　　　大规模DNA测序 基因型、基因突变和多态性分析 疾病的诊断与治疗 　　　　　　遗传病相关基因的定位 　　　　　　肿瘤诊断 　　　　　　感染性疾病的诊断 　　　　　　耐药菌株和药敏检测 聚合酶链反应(polymerase chain reaction reaction；PCR) PCR是八十年代中期问世的一种体外模拟体内DNA复制过程的技术，可在短时间内将待测特异性DNA扩增百万倍以上，并具有简单、快速、特异的特点，成为分子生物学发展史的又一个里程碑。 PCR不仅可检测各种DNA病毒的核酸，还可经过逆转录，检测各种RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交，有着不可替代的作用。 PCR 的常见类型 常规PCR 逆转录PCR（RT－PCR） 巢式PCR〔nested-PCR〕 原位PCR（in-situ PCR） 多重PCR ??… 实时荧光定量PCR荧光检测技术 SYBR Green I。是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan 水解探针。由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序列组成。 实时荧光定量PCR：水解探针法 TaqMan法应用 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 单核苷酸多态性（SNP）分析 Think You * * Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 μl of Patient Sera 基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。 上图显示大量的DNA探针，按照一定的规律有序地排列在支撑物上，每个探针与相对应的特异互补序列结合后，即可发出荧光。利用该芯片可同时获取大量信息。 DNA Microarray 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序