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蛋白质的降解 泛素介导的降解 溶酶体介导的降解(autophagy) 蛋白质研究手段 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS)； 双向电泳（等电聚焦+SDS); 质谱； Western印迹； 免疫组化； …….. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据电荷和分子质量的差异来分离蛋白质。 当阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。 同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物电泳时的泳动率差异，就反映了分子质量的不同。 因此，可以利用SDS测定蛋白质分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳，利用等电点不同分离蛋白质。(水平，X-轴） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：利用分子量大小不同分离蛋白质。（垂直，Y-轴） 二维 (Two dimensional) 凝胶电泳 二维 凝胶电泳 等电点由低到高 分子量由高到低 质谱，顾名思义就是可以测量物质质量的仪器。蛋白质或者蛋白酶降解的多肽片段可以通过质谱仪绘制出各组分的分子量图谱，然后对比数据库中的蛋白质或其降解肽段的质量，从而推算被测定蛋白质的身份(identity)。 质谱技术 二维电泳和质谱结合分析蛋白质功能示意图 Western 印迹 目的蛋白 一抗 酶标的二抗 免疫组化Immnuohistochemistry 蛋白质相互作用 研究一个蛋白质与一些已知蛋白质之间的相互作用，可以推断该蛋白质的生理生化功能。研究蛋白质相互作用的方法主要有： 亲和层析(affinity chromatography)； 免疫共沉淀 (co-immunoprecipitation); 酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system). 蛋白质亲和层析 (affinity chromatography) 原理：根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。 方法：将目标蛋白固定在亲和层析介质上(如sepharose 4B)，让细胞蛋白通过层析柱，与目标蛋白结合的蛋白质被留在层析柱上，然后洗脱下来，用质谱分析等方法进行鉴定。 应用：分离有相互作用的蛋白质。 亲和层析--亲和纯化 免疫共沉淀 (co－immunoprecipitation) 原理：利用抗原和抗体间的免疫反应，用特异抗体将目标蛋白和与其作用的蛋白质沉淀下来。 这一方法需要对目标蛋白高度特异的抗体。如果不能获得特异抗体，可利用DNA重组技术产成融合蛋白，如GST融合蛋白。 研究对象：研究细胞中蛋白质与蛋白质的相互作用。 免疫共沉淀 酵母双杂交系统是在1989年由纽约州立大学的Stanley Fields等初步提出并建立的，是在酿酒酵母中研究蛋白之间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。将相互作用的两个蛋白分别与转录因子的DNA结合域和转录激活域融合，在酵母细胞中通过报告基因的表达情况反映两个蛋白之间的相互作用。 酵母双杂交技术 酵母双杂交原理 高敏度的检测蛋白-蛋白的相互作用。 寻找在蛋白-蛋白相互作用中起关键作用的结构域。 寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。 酵母双杂交系统的主要应用 * * * 二维电泳: 从两种不同的条件中的细胞或组织中收获并溶解蛋白,蛋白粗提物首先根据等电点经过一维电泳分离,然后经过还原和烷化通过SDS根据蛋白分子量大小分离.胶固定后经银染显色,银染不如染色定量准确,但是更为敏感,且适于质谱分析.染色的后蛋白点被纪录并定性.感兴趣的蛋白可以切下后经质谱分析. * * 基因功能研究策略 1953年， Watson Crick提出DNA双螺旋结构模型 2003年4月14日，国际人类基因组宣布：人类基因组列图--“完成图”提前绘制成功。 人类基因组计划的信息 人类基因组大小约为2.9-3.2 Gb； 人类基因组中编码蛋白的序列不足5%； 人类基因组中有大约30，000个功能基因（即编码蛋白质）； 其中42%的基因功能尚不清楚。 功能基因组学就是动态的来研究基因的转录，翻译以及蛋白蛋白之间的相互作用。 RNA表达水平的研究 DNA array/gene chip 定量PCR 差异显示PCR 原位杂交 Northern印迹 DNA array/gene chip基因芯片 Real-time PCR (qPCR) Taqman probe vs.SYBR Green dye Data interpretation 差异显示PCR 原位杂交 利用特异