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冷冻干燥技术 广泛应用于药品、生物制品、化工及食品工业。对热 敏性物质如抗生素、疫苗、血液制品、酶激素及其他生物组织，冻干技术非常适用。 十字匀浆器 通用性差； 时间长，效率低； 有些化学试剂有毒 。 化学渗透法优点： 缺点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 不足： 易引起生化物质的变性，须在低温下操作，带来分离、回收化学试剂 的问题。如苯、甲苯、抗生素、SDS、EDTA、变性剂（盐酸胍脲）等化学药品可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物质选择地渗透出来这种处理方式称为化学渗透法自溶作用。 作用机理： 应用： 化学渗透与机械法比较的优、缺点: ①、②、③ （1）外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等 2、酶溶法（Enzymatic lysis）： 原理 外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、 β –1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等 内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等 酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的β一l，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解。对于革兰氏阴性菌需辅以EDTA。 真核细胞的细胞壁需采用不同的酶。 蜗牛酶适于酵母细胞的处理 （2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 应用：用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，细胞工程常用的方法。 酶溶法处理细胞存在的问题： ①存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。 ②酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。 ③通用性差，不同的菌株用不同的酶。 3、物理渗透法 原理: 适用范围: （2）反复冻结—融化法： 机理： 适用范围： （3）干燥法： （1）渗透压冲击法(Osmotic hock): （1）目前在工业生产中应用最广泛的细胞破碎方法：有高压匀浆法和高速珠磨机法。 （2）机械破碎法中存在的共同问题： （三）各种破碎方法的比较及选择 1、主要破碎方法的比较（参见P39-40） （4）物理法： （5）干燥法：较剧烈的一种破碎方法。 渗透压冲击、反复冻结—融化法。 （3）非机械法中化学法和酶法应用最广泛： 酶法 自溶法 抑制细胞壁合成的方法 细胞的处理量和细胞壁的强度； 目标产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等） 的敏感性 要达到的破碎程度及破碎所必要的速度等 具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术 把破碎条件和后面的提取步骤结合起来 2、主要破碎方法的选择依据 在固—液分离中细胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很难分离除去，因此，破碎时既要获得较高的产物的释放率又不能使细胞碎片太小。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这三方面来权衡。 选择的一般原则： A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 综合说明 由于细胞之间及目标产物之间性质差异很大，已有的破碎理论、破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据。 实际的破碎操作仍凭经验，即通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作参数，获得最佳破碎效率。 提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标产物的变性或失活。 机械法与酶法破碎的比较 机械粉碎法：处理量大，破碎速度较快。细胞受到由高压产生的高剪切力，大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏 酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。 选择合适的破碎方法需要考虑的因素：细胞的数量，目的产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；破碎程度及破碎速度等。 物理法和化学法的比较 物理破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分