第八章人体健康概论.pptVIP

3. 杂交瘤细胞的筛选 ： 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾细胞/?脾细胞 骨髓瘤细胞/ ?骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 脾细胞 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤 （1）抗原制备:对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。 （2）免疫动物：选择与所用骨髓瘤细胞同源的健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。 先给小鼠接种一个抗原，并在随后的几个星期内连续接种几次，但是几次免疫之间的时间间隔不能太短，以防动物死亡，一般2～3周.然后检测小鼠体内是否已经引起了免疫反应。如果发生了免疫反应，就杀死小鼠，取出小鼠的脾脏，清洗干净，研磨碎，制成B细胞悬浮液。 （3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备：采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 （4）细胞融合：将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞 （5）杂交瘤细胞的选择培养：一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 （6）杂交瘤细胞的筛选：在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 （7）杂交瘤细胞的克隆化（即单克隆生长） ：大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 （1）体内诱生法 ：取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 （2）体外培养法： 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。 （8）单克隆抗体的鉴定 （1）细菌 细胞直径约0.5?m，长0.5-5?m。 结构简单，基本形状有球形、杆形、螺旋形。 有的具芽孢、鞭毛或荚膜。 细胞壁坚韧，以二等分分裂繁殖为主，水生性较强，原核。 除部分自养细菌外，多营腐生或寄生生活。 遍布于土壤、水、空气、有机物质中及生物体内和体表。 对自然界物质循环起着巨大作用。某些种类能提高土壤的肥力。不少种类可用于发酵工业，生产食品、化学品和医药品等。某些种类可用于细菌冶金和石油脱蜡。若干种类能引起人和动植物病害或工农业产品的腐败。 第二节 主要致病因素和病原体 有益细菌 苏云金芽孢杆菌 根瘤菌 乳酸菌 几种常见的有害细菌 大肠杆菌 结核杆菌 腐败菌 金黄色葡萄球菌 破伤风杆菌 细菌的形态 球菌coccus 双球菌Diplococcus 链球菌Streptococcus：肺炎链球菌 四联球菌Tetracoccus 八叠球菌Sarcina： 葡萄球菌Staphylococcus：金黄色葡萄球菌 杆菌bacillus或bacterium：E.coli.、枯草杆菌、伤寒菌 螺旋菌spiral form bacteria：幽门螺杆菌、霍乱弧菌 细菌的结构 一般构造： 无真正细胞核，菌体中央有1个核区，无核膜、核仁。 多数细菌细胞膜外具有一层粘滑的刚性细胞壁。 无线粒体，依赖细胞膜进行能量代谢。 细胞膜向内凹陷延伸或折叠成内膜系统，代替叶绿体等细胞器。 有核糖体，可产生出细菌蛋白质。 多数细菌细胞