PCRSSCP简介及应用教案.ppt

莫 小贝 内容 PCR-SSCP基本过程 PCR-SSCP结果判定 PCR-SSCP基本过程 PCR及PCR-SSCP基本原理 PCR-SSCP基本过程 PCR-SSCP的实验操作 SSCP的应用 PCR-SSCP结果判定 PCR及PCR-SSCP基本原理 PCR-SSCP基本过程 (一)PCR的概念 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。 Kary Mullis PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的。 Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。 PCR的背景 相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强； 广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。 PCR-SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。 （二）PCR-SSCP的概念 二、PCR-SSCP基本过程 1．PCR扩增靶DNA。 2．PCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定 空间结构的DNA单链分子。 3. 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4. PAGE胶的银染 PCR-SSCP结果判定 单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，存在碱基突变. 有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别,因此一般要求电泳长度在16--18cm以上. 以检测限为指标来判, 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值,一般检测限定为3mm。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化。 实验原理 聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测，遗传病的致病基因分析和基因诊断，基因制图等领域。 在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 试剂与材料 1．样本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、30%丙烯酰胺（交联度49:1）、5×TBE缓冲液、10%过硫酸铵（现用现配）、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。 三、PCR-SSCP的实验操作 　　在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: DNA片段长度(核苷酸数) (%) 1Kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 12 　　在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾). 1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用. 3)银染法 　　将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色. 　2)电泳 　　取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5m