多聚酶链式反应扩增DNA片段-解析:.ppt

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温故知新1: 组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? DNA分子结构有什么特点? 复制特点 三、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 (一)设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管,总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体,其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 (二)实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程:盖严微量离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁。 ②注意: 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁,目的是使反应液混合均匀。 A、离心管口的盖子一定盖严,防止实验中脱落或液体外溢。 将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序。 ①过程:将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4、离心 5、反应 ②离心目的:使反应液体集中在离心管底部,提高反应效果。 PCR三步曲 预变性 保温 变 性 94℃ 30s 延伸 72℃ 1min 复性 55℃ 30s 94℃ 5min 72℃,1min 55℃,30s 94℃,1min 最后一次 72℃,1min 55℃,30s 94℃,30s 30次 - - 94℃,5min 预变性 延伸 复性 变性 循环数 PCR技术高度灵敏,为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验,PCR操作时要注意做到: 6、注意事项 ①隔离操作区,所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌; ②PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。 ?分装试剂,简化操作程序,使用一次性枪头 (一)理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA,复制n次, DNA为2 n 2 、 a条DNA,复制n次, DNA为a x2 n (二)实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰, 峰值的大小与DNA的含量有关 稀释 2μLPCR反应液,加入98L蒸馏水,即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零 测定 取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值 计算 DNA含量( ?g /ml )=50 ×(260nm的读数)×稀释倍数 2.过程 比色杯 五、实验小结 PCR仪加热使( )变性, 复性使引物与模板DNA( ),延伸需将反应温度升至中温( ),在( )的作用下,以 ( )为原料,以( )为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经( )三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃ 1.提示:绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累,其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段 (2n=230=1 073 741 824)。 2.提示:PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验,感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》(见本专题参考书目),书中有详尽的论述。 课后题: * * 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术),是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为DNA体外扩增技术。 1 2 3 4 5 DNA的基本单位-脱氧核苷酸 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 脱氧核苷酸链结构简图 磷酸二酯键 A T G C A G C T DNA分子的平面结构 氢键 5'端 3'端 5'端 3'端 DNA分子的复制过程是怎样的? DNA分子的复制需要哪些条件? 温故知新2 DNA母链:提供复制的模板 解旋酶:打开DNA双链 4种脱氧核苷酸:合成子链的原料 DNA聚合酶:催化合成DNA子链 ATP:为复制过程提供能量 引物:使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA复制的条件 半保留复制,边解旋边复制

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