王镜岩-生物化学-第12章-核酸通论资料.pptVIP

一、核酸的分离、提纯和定量测定 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4~ 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。 碱基 adenine 4.15, 9.8 cytosine 4.5, 12.2 guanine 3.2, 9.6 thymine 9.9, 13 核苷 adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8 cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13 guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5 uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13 核苷酸 AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4 ADP 3.9, 6.3 : --------- CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6 GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7 UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0 二、核酸的酸碱性质 碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 碱基中的H原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。 在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。 碱基、核苷、核苷酸的pK值 三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g DNA分子的变性 四、核酸的变性，复性及杂交 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G+C)%， 或GC%=（Tm-69.3）×2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大。 4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。 SSC溶液，常用于DNA的溶解。 (二) 复性 T1/2 × C ＝ const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素 1.DNA的片段越大,复性的速度越慢; 2.DNA的浓度越高,复性的速度越快; 3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快; 4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低; 5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。 DNA复性与Cot分析 当 C/C0=1/2时， k=1/C0t1/2 Watson-Crick的DNA双螺旋 双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。 稳定双螺旋结构的作用力为氢键、碱基堆积力（即疏水作用）和环境中正离子的作用。 碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。 5.DNA双螺旋分子结构的不同类型： 主要有三种，分别命名为A、B和C型。其中B型与Watson-Crick提出的模型一致，A和C型在低相对湿度的条件下形成，它们的螺距都比B型要短，A型DNA的结构与DNA和RNA的杂合链相似。Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中发现，后用抗体证明天然DNA中也有，它是一种左手螺旋，在细胞中可能与基因表达的调控有关。 螺距 残基数 碱基倾斜 A型(75%,Na) 2.8 11 20° B型(92%,Na) 3.4 10 0° C型(66%,Li) 3.1 9.3 6° D/R hybrid 2.8 11 20° Z型 4.6 12 9° Z-DNA的结构特点： （1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。 （2）左旋。 （3）G