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DNA重组实验中常用的技术 一、质粒DNA的提取及鉴定 　　（一）质粒DNA的提取及鉴定 　　1．收获细菌 　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37剧烈振荡培养过夜。 　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4。 　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 　　2．碱裂解法小量抽提质粒 　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 　　（2）加200μl新配制的溶液（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。 　　（3）加150μl预冷溶液（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。 　　（4）4以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。 　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。 　　（7）4以12000g离心5min。 　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。 　　（9）用75%乙醇于4洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。 　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20。 　　（二）质粒DNA的大量制备 　　（1）同上1.（1） 　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37振荡培养至A590=1.0(5～6h)。 　　（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37温箱中培养过夜。 　　（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。 　　（5）加溶液5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。 　　（6）加溶液10ml轻轻混匀，室温下5min。 　　（7）加溶液7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4离心20min。 　　（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-203～5h。 　　（9）15000rpm 4 离心20min。 　　（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。 　　（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42水浴4h于过夜。 　　（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。 　　（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。 　　（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。 　　（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-203～5h。 　　（16）10000rpm 4离心20min。 　　（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。 　　（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。 　　（三）质粒DNA的鉴定 　　1．酶切反应 　　（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37水浴1h以上。 　　（2）取反应物点样，观察酶切效果。 　　（3）酶切完全后，705min终止反应。 　　2．琼脂糖电泳 　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。 　　（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。 　　（3）打开电源开关，5V/cm电泳。 　　（4）在UV灯下观察电泳结果。 　　二、DNA的重组 　　（一）DNA的酶切与连接 　　（1）酶切反应 　　同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。 　　（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-202h以上。 　　（3）15000rpm离心15min，弃上清。 　　（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。 　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。 　　（6）测定DNA的含量。 　　（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14反应12～16h。 　　（8）连接反应液可置-20保存，供转化用。 　　（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。 　　（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化 　　1．感受态的制备 　　（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37过夜